RNA测序遇上Dup，有你想不到的误区 | BGISEQ平台低Dup rate优势全解
【知识卡片】什么是Dup？Dup，即重复序列Duplicate reads，指通过测序得到两对或两对以上的Pair-End Reads，同时比对到参考基因组上相同的起始和结束位置的序列。这些重复序列在总测序序列中的占比简称为Dup rate。
Dup会影响DNA测序变异检测结果准确性，需要在生信分析中去除，只是会产生测序成本浪费。RNA测序遇上Dup，问题就更复杂了。一类Dup是建库或测序过程引入的“坏”Dup，另一类Dup是样本高基因表达形成相同模板的“好”Dup。
如果不分“好”“坏“全去，就会损失这部分“好”的数据；如果不去，Dup会影响RNA测序基因表达定量的准确性。如何识别和去除RNA测序“坏”Dup，一直是一个热点，众说纷纭，方法各异。
01、Dup如何影响RNA测序？
相关文献报道：
（1）高Dup rate会影响差异表达基因的检测。
Sergi Sayols等人[1]从数据库获取RNA-Seq数据，模拟PCR Dup rate 50%和90%。Dup rate 50%时，能还原出原数据1199个差异表达基因，产生124个假阳性和720个假阴性；Dup rate 90%时，问题加重，只还原出517个，产生115个假阳性和1402个假阴性（图1 D-F）。
（2）对于低表达基因，Dup rate偏移程度更大。
Sergi Sayols等人[1]还分析了不同Dup rate程度下，低表达基因的偏移。本来低表达基因表现低Dup rate，随着基因表达水平升高，Dup rate升高。但在高Dup rate的情况下，低表达基因已经出现了高Dup rate（图1 A-C）。
图1 不同Dup rate程度，对同一文库中检测差异表达基因的影响
（3）对于较短的基因，打断时更易产生相同的reads，被当作Dup。
Yu Fu等人[2]指出相同的表达水平下，短的基因比长的基因，reads更可能被当成Dup，因为在建库时有一步骤是将RNA随机片段化，对短的基因来说打断成不同片段的“空间”更小。
02、PCR Dup是干扰RNA测序的“罪魁祸首”吗？
RNA测序Dup是怎么产生的？来源有以下4个：
（1）样本本身的Dup；
（2）文库构建中扩增引入的Dup（即PCR Dup）；
（3）测序前信号放大（荧光信号采集单元生成过程）引入的Dup；
（4）芯片测序过程中引入的光学Dup。
大多数人认为Dup主要来自于第2种，即建库环节中引入的PCR Dup，因而目前的文章中以降低建库环节引入的PCR Dup为主，或在生信环节通过开发软件，识别出PCR Dup；或在建库环节通过加分子标签，依据带有相同标签判断为PCR Dup。
PCR Dup真的是“罪魁祸首”吗？此前的文章（《NGS攻略》之Dup传）详细地剖析了前人文章和实测数据，分辨每种Dup的“影响力”。PCR Dup在扩增循环数目不高的情况下，并不会带来“令人窒息”的Dup rate，而只是在个位数水平波动。实际上第3种和第4种，即测序引入的Dup居多。
03、测序引入的Dup rate有多大？
从上百个商业样本DNA测序看，BGISEQ和H平台Dup rate的差距明显，BGISEQ平台在3%以下，H平台>20%（Duplicates | NGS帝国的Agent Smith）。RNA测序表现如何呢？
1. 人标准品数据
（1）真核转录组测序
人标准品UHRR构建真核转录组文库，分别在BGISEQ和H平台上机，测序策略PE150。BGISEQ Dup rate，仅有9%左右， H平台高达22.67%。（表1）。
（2）lncRNA测序
人标准品UHRR构建lncRNA文库，分别在BIGSEQ和H平台上机，测序策略PE100。BGISEQ Dup rate，仅有13%左右，H平台超过20%（表2）。
2. 商业项目统计
统计近期BGISEQ PE150测序的真核转录组商业项目，涉及多种植物、动物和真菌共152个样本，平均Dup rate仅为10.36%，而H平台29个样本，平均28.74%。
图2 近期BGISEQ真核转录组商业项目情况
从RNA测序数据中不难发现，单看BGISEQ平台结果，4种Dup来源加一起也不过百分之十，而两个平台间就差了百分之十几。可见测序引入的Dup比其他Dup多得多，BGISEQ平台Dup rate很低。
04、BGISEQ Dup rate为什么这么低？
这得从原理上说起，BGISEQ平台基于独特的核心技术，减少了测序环节引入的Dup，使得Dup rate明显低于H平台。
原因1：BGISEQ平台采用DNB技术，PCR双链文库在后续环化实验中只环化双链中的1条，滚环扩增获得DNA Nanoball；另外一条则被核酸外切酶消化，不用于形成DNA Nanoball，因此是单链的模板。
而H平台，是双链PCR产物变性与芯片的接头互补连接，双链中的两条链是一样的信息，都可以在后面桥式扩增中作为模板，这样引入的Dup比BGISEQ平台高。此外，BGISEQ平台是线性扩增，始终只复制原始模版，其扩增错误不会像H平台桥式PCR一样累积成指数型放大。
原因2：BGISEQ平台采用Patterned Array技术，制备好的DNB会加载到微阵列芯片（Patterned Array）上，这一过程称为DNB加载。Patterned Array技术通过先进的半导体精密加工工艺，在硅片表面形成阵列和对准标记，因而芯片上活化位点是规则阵列的，而且DNB与芯片上活化位点的大小相近，每个位点只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相互干扰。再结合高分辨率成像系统和自主开发算法等提高了图像处理精准度，大大提高了碱基识别准确度。
而H平台有两种芯片，一种是较早系列，采用非阵列式芯片，生成的DNA cluster形状不规则，图像识别有可能把一个cluster识别成两个，会造成Dup的问题；另一种是近年来的超大通量测序平台，为了更多有效数据，采用阵列式芯片，在进行第一条互补链合成后，DNA模板分子会脱落，并有一定的概率到达另一个纳米孔生成另一个相同的cluster，造成Dup的问题。
图3 BGISEQ平台原理图
BGISEQ平台独具低Dup rate先天优势，就无需在生信环节人为地设计软件去除，也免去建库环节费尽心力地人为干预样品建库，省时省力省钱。
BGISEQ RNA测序产品亮点颇多，除了低Dup rate，还有：
11天极速交付：BGISEQ真核转录组和RNA-Seq，提取检测为起始，有参无参都极速。提取2天；打包服务包含检测，RNA-Seq 只需要11天，真核转录组只需要14天。
“0”index hopping：独特的文库构建技术和单链环状文库滚环扩增技术使得index hopping在0.0001%~0.0004%，远低于H平台[3]。
Dr. Tom 2.0多组学：任意测mRNA/lncRNA/Small RNA一种，获取多组学的关联信息，多数据库联合分析和多维度图片展示，调用丰富的多组学关联分析工具，深度循环挖掘数据，还可自由上传数据和自定义目的基因分类。
1000+累积影响因子：RNA测序在《Nature》、《Cell》、《Immunity》、《Nature Neuroscience》、《Cell Research》等顶级期刊发表过多篇文章；单细胞转录组文章4月荣登《Genome Biology》，BGISEQ平台定量灵敏准确[4]。
参考文献：
[1] Sayols S, Scherzinger D, Klein H. dupRadar: a Bioconductor package for the assessment of PCR artifacts in RNA-Seq data. BMC Bioinformatics. 2016 Oct 21;17(1):428.
[2] Fu Y, Wu PH, Beane T, et al. Elimination of PCR duplicates in RNA-seq and small RNA-seq using unique molecular identifiers. BMC Genomics. 2018 Jul 13;19(1):531.
[3] Li Q, Zhao X, Zhang W, et al. Reliable Multiplex Sequencing with Rare Index Mis-Assignment on DNB-Based NGS Platform. bioRxiv. 2018: 343137.
[4] Natarajan KN, Miao Z, Jiang M，et al. Comparative analysis of sequencing technologies for single-cell transcriptomics. Genome Biology. 2019 Apr 9;20(1):70.
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