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关于蛋白定量的N个问题,这篇帮您一一解答!

近期华大基因打造了2款仅需13天极速交付的蛋白组定量产品,受到了合作伙伴的热切关注。蛋白质组学研究日趋火热,也引发了诸多问题和担忧,科技君在这里帮您一一解答。


文末有(免费)惊喜!


问1:同为蛋白定量产品,非标记定量和标记定量的适用场景有何差别?

标记定量分析技术可同时比较2-10组样品之间的蛋白组表达差异,是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。而非标记定量技术不需要标记,定量样本数不受限制,其中蛋白DIA定量分析技术被《Nature Methods》杂志评为2015年最值得关注的技术之一,具有定量准确性高、技术重现高的优点。


两相比较之下,非标记定量DIA更适用于以下情况:

1)实验组数高于10组;

2)样本来源于不同物种、不同组织或不同部位,需进行平行蛋白组定量检测;

4)需要区分样本中的“有无蛋白”;

5)追求更精准的定性和定量效果,避免标记和液相分组引入的实验误差;

6)需要对采集的数据进行多次重挖掘分析。


两相比较之下,标记定量iTRAQ/IBT更适用于以下情况:

1)实验组数低于10组(即同时比较的样本数≤10);

2)样本背景较为相似(相同物种和相同的样本类型)。


这么看来,如果您的样本量>10,想不受限制地获得更为丰富和精准的数据,DIA将是更合适的选择详情请点击


问2:蛋白定量研究结果的等待时间太长?

目前市面上常见的蛋白组定量产品的交付周期超过半月,为了给科学研究带来更极致的体验,华大推出了极速交付的蛋白组定量产品,从样本检测合格到数据产出,仅需13天!同时保证品质无损、价格更优。详情请点击

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问3:如何保障蛋白定量的准确性?

除了追求鉴定数量和价格,定量准确才是硬道理。基于10+年的项目经验,华大定量蛋白质组学产品始终坚持高品质保障,从样品接收、蛋白提取、蛋白酶解、肽段除盐、标记、分离、质谱检测、数据下机、数据解析、统计分析到最后的结果交付,全过程有47项严格的质控指标把控,造就高品质高准确性的数据结果,为科学研究奠定扎实的基础。

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图1 华大蛋白定量产品拥有的质控环节


问4:如何选择一个稳定可靠的质谱平台?

Nature子刊Nature Communications在2017年8月公布了由质谱与蛋白质组学领域大咖、苏黎世联邦理工学院(ETH Zurich)Ruedi Aebersold教授牵头的,全球11家实验室DIA定量蛋白质组技术对比的评估结果。结果显示:华大质谱实验室平台(编号10)在蛋白鉴定和定量稳定性都处于领先水平详细信息请点击

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图2 蛋白鉴定的数目和一致性

每种颜色代表一个实验室的所有数据,11个实验室所有数据集的重复性中位数是91.6%(蛋白水平)和79.5%(肽段水平)

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图3 变异系数

比较单个实验室一天内及多天内的CV变化,以及不同实验室间的CV变化


问5:在实际项目中,华大蛋白定量的结果表现怎么样?

1)大规模样本定量QCs测试表现:

在>100个样本的DIA蛋白定量检测项目中,从前到后运行中每隔12小时穿插一个QC,17个QC之间定量相关性达到0.99,华大质谱定量蛋白质组体系一直具有超高稳定性和重现性,这是定量准确性的基本保证。

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图4 17个QC之间定量相关性评估


2)定量准确性测试评估:

在华大DIA定量实验中,将已知蛋白标品混合物按照1:2:4的比例混入复杂样品作为内参,然后将内参标准蛋白的实际定量比值与理论比值进行比较。测试结果表现为理论与实际定量结果基本一致,且CV值小,定量准确性高。

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图5 对比内参标准蛋白的实际定量比值与理论比值


3)验证一致性:

MRM/PRM是定量蛋白质组常用的验证手段,对华大已执行的项目进行差异蛋白验证一致性统计,大部分项目验证一致率超过80%。

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图6 部分文章发表数据统计


问6:有哪些容易忽略的关键点会影响蛋白定量的准确性?

对于标记定量蛋白质组技术(iTRAQ/IBT/TMT),其优势在于将所需比较的样品标记后混在一起无偏好地同时进行后续实验和质谱检测,消除了系统实验误差,使得定量可比性更直接。但是,标记定量技术带来的另一个问题是共洗脱等因素导致的定量比值压缩效应(Nat Methods. 2011 Oct 2;8(11):937-40),也就是说,实际定量检测到的差异倍数会比真实差异倍数小。所以,对于标记定量蛋白质组分析得到的感兴趣关键蛋白,通常建议后续做进一步的PRM或MRM验证其定量准确性。


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