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2个样本怎么发paper?单细胞转录组技术来帮忙!

近日,由华大基因团队主导的对2个脐带血样本进行10X Genomics单细胞转录组研究的成果于5月正式在线发表,此项研究采用BGISEQ平台测序,发现脐带血细胞具有特有细胞类型,相对外周血细胞具有明显异质性,相关结果发表在GigaScience(影响因子4.668)。如此少的细胞样本,竟能发高分文章?光环背后必然有过人之处,接下来科技君带大家一起研究文章思路,一一揭秘。

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图1. 文章整体研究思路图


【高分秘籍】

✔  样本处理很成功

看似无奇的两个脐带血样本,但是细胞分选前处理不易,每一步均需要快速稳定处理,才能保证细胞活性,所以说,“根基”牢靠才是重中之重。

✔ 高通量细胞分选技术 & 高性价比、高质量DNBSEQ™测序技术

实现高效细胞分选,结合独特的DNB纳米球扩增技术,让测序更保真,低DUP rate无需额外去冗余。

✔  信息分析深挖掘

不仅对细胞类型进行鉴定,还与已有的外周血细胞数据一起对比分析,选择数据库已测数据联合,性价比高又增分。

细胞亚群异质性分析细致,多种类型,尤其是对免疫细胞以及特有细胞类型对比分析,凸显脐带血含有特异性免疫细胞;还包含对已有细胞类型进行细胞发育拟时间序列分析,分层次揭示阶段性的基因表达差异,科学故事演绎完整。

原来如此,那么主要研究结果有哪些呢?


【研究成果展示】

01、鉴定到特有细胞类型,脐带血细胞具有特殊的免疫力


采用Seurat软件进行细胞聚类,结果显示:鉴定到11个细胞类型(图2A),并对这11个主要的细胞类型的marker基因表达情况进行热图分析(图2B)。其中有核红细胞和粒细胞为脐带血中特有,在外周血中很少见。且两类血液中各细胞类型除去T细胞,B细胞和CD14+细胞外,其他的类型细胞的比例差异较大,尤其是骨髓来源细胞,说明脐带血具有特殊的免疫力。

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图2. 外周血和脐带血不同细胞类型和比例

A. 二维对外周血和脐带血细胞根据已知标记进行分类,左侧图为脐带血细胞,右侧图为外周血细胞,对相同类型的细胞标记相同的颜色

B. 脐带血和外周血中主要的已知标记的基因表达热图

C. 外周血样本1/2 和脐带血1/2细胞类型比例,使用相同的颜色(同分类A)标记


02、
脐带血有核红细胞在不同极性发育阶段变化明显


对有核红细胞的表达基因进行拟时间序列分析,结果呈现一个线性轨迹,说明细胞极性是由基因表达的不断变化引起的(图3A)。


基因表达热图分析发现,这些基因如编码红细胞表面marker和蛋白,如 CD47, CD36, 血红蛋白和血糖型蛋白,以及细胞稳态调控因子等在不同的极性阶段表达呈现显著差异(图3B,C),同时也验证到基因表达量和UMI数量也随着细胞极性发育而降低。

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图3. 脐带血有核红细胞呈现明显的极性

A. 通过Monocle2软件进行脐带血中的有核红细胞发育时间轨迹分析

B. 编码表面标记基因表达分类根据时间点分为三个表达阶段:原始阶段,中间阶段,成熟阶段

C. 脐带血有核红细胞转录调控因子表达也可以分为三类表达阶段:原始阶段,中间阶段,成熟阶段

D. 在每一个细胞中检测到UMI数和基因数表达散点图,每个点代表一个细胞


03、脐带血祖细胞具有明显异质性


脐带血的祖细胞与造血干细胞呈现类似的转录本表达谱,但是在细胞聚类结果中显示,通过更精细分类分析,发现脐带血祖细胞有一类特殊细胞亚群,说明脐带血祖细胞具有异质性(图4A.B),更有意思的是,另外一类亚群细胞仅来自脐带血祖细胞(蓝色点),且不表达造血干细胞的典型标记基因(图4C,4D)。

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图4. 脐带血样本祖细胞呈现异质性特征

A. 脐带血和造血干细胞通过基因表达结果进行聚类,结果显示,主要分两大类,其中蓝色代表脐带中间体双效细胞(ulBC),红色代表造血干细胞(HSC)

B. 造血干细胞(HSCs)和中间体双效细胞(uIBCs)群体进行聚类

C. 祖细胞亚类基因表达热图分析

D. 两类细胞的特征基因表达差异比较的小提琴图

E. 两类细胞转录因子富集图

F. 两类细胞特异性转录组因子小提琴图


04、自然杀伤T细胞在脐带血细胞中表现异质性


选择免疫细胞类型-NK细胞和T细胞以及附近区域细胞研究其异质性,结果显示,外周血细胞和脐带血细胞聚类成5个亚类(图5), 通过使用关键marker基因CD3D和KLRB1对细胞进行聚类,发现:T和NK细胞在不同血液类型中呈现比较明显的异质性。

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图5. 在脐带血和外周血中NKT细胞和NK细胞显示功能异质性

A-D. 脐带血(右)和外周血(左)中所有NK细胞和T细胞进行亚群分类。脐带血和外周血均分为5大类(C/D)。黄色显示CD3D的高表达;蓝色表示KLRB1高表达细胞;红色表示高度表达CD3D和KLRB1的细胞;灰色表示细胞不表达基因

E. 脐带血和外周血中单细胞亚群中NK细胞和T细胞关键基因表达差异的小提琴图(不同颜色代表不同亚群)

F. 脐带血中含有GZMB+ NKT细胞和不含细胞毒素NKT细胞亚群表达基因差异的聚类热图

G. 脐带血中含有GZMB+ NKT细胞和不含细胞毒素NKT细胞亚群表达基因GO功能富集分析


总的来说,这项基于单细胞转录组技术的研究揭示了未知的细胞类型、代谢途径和基因表达调控,这些调控可能有助于评估脐带血移植的疗效和结果,拓宽了研究范围和临床创新。


华大科技推出的10X Genomics单细胞转录组技术,采用BGISEQ平台,经过多轮测试,其灵敏度、准确度和重现性方面与H平台具有高度可比性,为广大科研人员提供了另一种高性价比测序平台的选择。


DNBSEQ™测序技术BGISEQ-500平台优势

✔  鉴定细胞数多

✔  鉴定的单个细胞基因中位数可到1.5K以上

✔  两平台鉴定到的细胞分类类型一致性高


表1. 主要基本分析结果对比

(数据来源肿瘤细胞各1条lane测序数据)

表格-3


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图6. BGISEQ-500平台和H平台细胞进行降维分析-tSNE聚类分析,结果显示,细胞分类结果趋势一致性高

(红色:BGISEQ-500平台;蓝绿色:H平台)


基于10年的单细胞研究经验,华大科技已成功交付千例单细胞研究项目。现在,科研用户足不出户即可享受优质的10X Genomics上门建库服务,珍稀临床样本研究成为科研新贵。



【参考文献】

Zhao Y, Li X, et al. Single-cell transcriptomic landscape of nucleated cells in umbilical cord blood. GigaScience. 2019 May 1;8(5). giz047.  doi: 10.1093/gigascience/giz047.


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