流式分选，高分单细胞研究文章的新利器！
随着Droplet-based单细胞技术的广泛应用，全民单细胞时代已到来。在一大波的单细胞研究应用和产品中，如何才能把最优的产品与最好的技术相结合，让项目脱颖而出？
科技君隆重推荐一个新秘籍——流式分选！通过流式分选做进阶式的研究，不仅让单细胞测序更有深度，还可以对高通量测序绘制的细胞图谱进行辅助验证，死细胞过滤更是有助于减少样本中死细胞的比例，提高实验的成功率！
本文让我们一起看看高分文章的应用实例！
目的细胞筛选
根据细胞表面标记物表达，流式细胞术有助于使表型与功能性输出（如细胞因子释放、转录因子的产生或磷酸化所致的激活）相关联，让单细胞测序研究目的性更强，研究更深入。
案例1：流式分选+10X Genomics RNA-Seq
杂志：《Immunity》
影响因子：19.24
发表日期：2019.09
样本/细胞类型：三个临床病人手术切下的4个腋下淋巴结组织，以及两个临床病人手术切下的颈部淋巴结组织。
文献：Single-Cell Survey of Human Lymphatics Unveils Marked Endothelial Cell Heterogeneity and Mechanisms of Homing for Neutrophils
研究主题：通过单细胞测序，揭示人类淋巴管道内皮细胞的异质性和中性粒细胞回稳的分子机制；某些癌症，如乳腺癌、头颈部癌症，主要通过淋巴系统扩散。
数十年来，淋巴脉管系统被认为只是一些管道：细胞和体液从身体的外围部分返回血液的管道。通过对淋巴结进行消化，随后迅速进行流式分选，富集到了PDPN+CD31+淋巴细胞后，并结合10X Genomics RNA-Seq测序分析，发现了淋巴管道系统也存在异质性，可分为6组不同的淋巴管，它们分别位于淋巴结的重要位置，表达着各自典型的分子。
此项研究证明中性粒细胞位于淋巴结外血管口把守，在必要的情况下引发炎症，以防止病原体蔓延到身体其他地方；同时也揭示了人类的防御机制和癌症的传播机制。研究成果为理解分子水平上的防御机制开辟了新的视角，结果还给药物开发提供了调节免疫防御和防止癌症的扩散潜在的新目标分子。
图1 单细胞RNA-Seq揭示了6种人类不同的LECs的表达谱。从三个临床病人手术切下的4个腋下淋巴结组织，以及两个临床病人手术切下的颈部淋巴结组织。淋巴结被消化后，迅速进行流式分选，富集到了PDPN+CD31+淋巴细胞后，进行10X Genomics RNA-Seq测序分析。
案例2：流式分选+10X Genomics ATAC-Seq
杂志：《Nature Biotechnology》
影响因子：30.15
发表日期：2019.08
样本/细胞类型：基底细胞癌组织内的CD8+ T细胞以及CD4+T细胞。
文献：Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion
研究主题：
肿瘤内T细胞衰竭的大规模平行单细胞染色质图谱绘制。通过对接受抗程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)免疫治疗(PD-1阻断)的基底细胞癌(BCC)患者的原发性肿瘤的研究，将解离后的细胞悬液，利用流式分选技术，富集T细胞群体后，进行ATAC-Seq。确定了治疗反应性T细胞亚群的染色质调控因子，发现肿瘤细胞群表现出患者特异性，反映了由患者特异性基因组改变驱动的细胞状态变化，推测与肿瘤发生相关的重要调节因子在免疫细胞中存在不同的激活调控机制。并通过时间轨迹分析，揭示控制肿瘤内CD8+ T细胞衰竭和CD4+ T滤泡辅助细胞发育等共同调节机制。
图2 流式细胞分选后的T细胞进行细胞亚群分类图
图3 通过拟时间序列分析Tfh和CD8+ T细胞谱系发育轨迹
高通量细胞图谱辅助验证
通过Droplet-based的高通量单细胞技术得到的细胞聚类分群结果后，可以再次使用流式细胞分选术进行目的细胞群体的筛选，从而验证高通量单细胞测序技术分析结果的准确性。
案例3：流式分选+10X Genomics 免疫组库
杂志：《Nature Communications》
影响因子：12.124
发表日期：2019.08
样本/细胞类型：全血分离出来的PBMC
文献：Dissecting the heterogeneity of DENV vaccineelicited cellular immunity using single-cell RNA sequencing and metabolic profiling
研究主题：
利用高通量单细胞免疫组库测序方法，揭示了登革热四价疫苗诱导的T细胞免疫机制。
T细胞介导的特异性细胞免疫反应，是防治登革热和其他病毒性疾病的强有力且非常重要自身免疫反应；尽管疫苗可以诱导和扩增T细胞（机体适应性免疫系统的关键部分），但在决定T细胞反应的大小、多样性和持久性方面，目前大部分科学研究对其中的细节还不清楚。此项研究结合了流式细胞术&单细胞免疫组库分析与标准的免疫监测手段发现了一种标记物——转铁蛋白受体1 (TfR1)，且利用这种蛋白可以鉴定CD8+细胞的分化潜能，同时，研究结果表明T细胞免疫依赖于特定的代谢物。基于发现的这系列转录特种，可定义一组标志物以判断最持久的疫苗反应性CD8+T细胞，以评估疫苗诱导的细胞免疫的程度、多样性和持久性等。通过单细胞表达量测序分析，发现了TfR1+HLA-DR+ or CD38+HLA-DR+CD8+ 的T细胞亚群，以及NS1或NS3激发的免疫CD8+T细胞亚群，同时进行了流式细胞分选后也得到了相应的细胞亚群。
图4 疫苗介导的CD8+ T细胞跟TfT1因子的表达相关。通过单细胞表达量测序分析，发现了TfR1+HLA-DR+ or CD38+HLA-DR+CD8+ 的T细胞亚群，以及NS1或NS3激发的免疫CD8+T细胞亚群，同时进行了流式细胞分选后也得到了相应的细胞亚群。
死细胞过滤
除了以上两大优势，流式分选还可以减少样本中样本中死细胞的比例，从而提高Droplet-based的单细胞文库构建的成功率以及后续的数据质量。该应用目前较少，后续有更新的文章再分享。
华大基因单细胞平台近期隆重推出了流式细胞分选服务，引进了SONY SH800S Flow Cell Sorter流式细胞分选仪。该分选仪是索尼第三代全自动流式细胞分选仪，基于索尼专利的CoreFinderTM技术、结合专利技术的的微流体分选芯片对液流全方位操控，从而在所有液流调试和光路校准步骤均实现了自动化，并能在分选过程中对液滴状态进行实时监控和自动调节，既大大简化了仪器操作过程，又保证了分选结果的稳定性。
