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10X Genomics单细胞免疫组库

产品概述

单细胞免疫组库技术就是基于以上免疫组库技术基础上,进一步实现的单个细胞水平上的免疫组库的研究。随着科研要求的不断增高,以及技术手段的不断发展,免疫组库的研究也正逐渐向更精细的方向发展,单细胞免疫组库测序技术可协助科学家从另一个角度认识这个复杂的系统。配合针对性的单细胞免疫组库分析算法及分析工具,可以观察在群体水平无法解决的,尤其是在免疫系统发育和反应过程中免疫细胞存在的一些罕见及中间细胞状态。B 细胞和 T 细胞的单细胞 RNA 测序即可以在单细胞的分辨率下捕获定量基因表达和免疫组库信息。

利用10X Genomics单细胞免疫组库技术,可实现在单个细胞水平中,同时对转录组基因表达和适应性免疫受体库进行研究,为免疫组学研究提供更具扩展性的平台。其基于10X Genomics平台,一次性能够分离500~10000个单细胞,并可以同时获取5’基因表达的数据和TCR/BCR的V(D)J全长序列。是一种高效的同时检测表达和免疫组库的技术,在肿瘤微环境、感染性疾病、器官移植后排斥、免疫治疗等研究领域中有着广泛的应用。


产品优势

更专业的单细胞研究团队:单细胞Droplet技术、微流控方向资深研发技术总监率领的研发团队。

更丰富的项目经验:华大基因成立至今,单细胞测序技术服务时间长达10余年,期间,合作伙伴遍布全球,多项科研成果在顶尖杂志上发表。

更多样的样本类型:可接受常规的细胞悬液样本、细胞系样本以外,还可以接收组织样本,提供组织解离服务(肿瘤组织)。

 

技术原理

基于10X Genomics平台的高通量单细胞免疫组库研究方法: 结合了10X Genomics平台的高通量单细胞RNA-Seq技术以及5’末端的快速扩增法的原理;利用液滴法的原理,使用GemCode技术,通过控制微流体的进入,将带有barcode、UMI(Unique Molecular Index,分子标签)、引物及酶的凝胶珠(Gel Beads)与单细胞混合,从而实现大规模的单细胞分离(图1);随后凝胶株破乳,释放出的cDNA可分做两份,一份可进行5’RACE mRNA基因表达定量文库构建,另一份可用于免疫组库文库构建。在构建免疫组库文库过程中,TCR或者BCR的V(D)J序列可以通过设计一或更多的巢式PCR引物对TCR或者BCR、lg的C区域进行富集(图2);构建完整的的5’RACE mRNA文库结构以及TCR/BCR文库结构(如图3)。随后通过高通量测序,即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据,从而实现在单细胞水平同时对基因转录本和免疫组库进行高通量测序的新方法。

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图1,10X Genomics单细胞免疫组库文库构建技术示意图

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图2,cDNA的扩增以及测序文库的构建原理示意图

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图3,文库结构示意图

 

技术流程

首先将样本制备成单细胞悬液,随后进行上机前细胞计数和细胞活率检测,将制备好的细胞悬浮液利用微流控芯片,将带有细胞标签序列(cell  Barcode)的凝胶珠(bead)和细胞包裹在液滴中。在液滴中,细胞破裂,释放的mRNA与凝胶珠上的细胞标签序列相连,形成单细胞GEMs结构(Gel Bead in Emulsions)。细胞的mRNA在液滴中进行逆转录反应形成cDNA,随后破乳,破乳后对 cDNA 进行BCR/TCR/5’RNA-Seq文库构建。通过文库序列上的细胞标签序列可以区分目标序列来自于哪一个细胞,并进行随后的生物信息分析。

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图4,技术流程

测序策略

测序平台:MGISEQ-2000平台

测序读长(5' RACE mRNA-Seq文库):建议PE100/PE150

测序读长(TCR/BCR文库):建议PE150

数据量推荐(5' RACE mRNA-Seq文库): 细胞系样本,建议每个细胞平均测:50,000条Raw Reads;组织样本,建议每个细胞平均测:500,000条Raw Reads;PBMC样本,建议每个细胞平均测:50,000条Raw Reads。

数据量推荐(TCR/BCR文库):建议每个细胞至少测5000条Raw Reads起。


产品信息分析内容

表1  5' RACE mRNA-Seq文库信息分析内容列表

信息分析条款

信息分析内容

标准信息分析

(需要基于良好的参考序列, 且每个样本拆分出的细胞数目上下浮动在20%或以内的误差皆属于正常范围)

1. 测序结果统计

2. 数据质控统计

3. 比对结果统计

4. 基因表达定量分析

定制化信息分析

可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析内容。

表2   TCR/BCR文库信息分析内容列表

信息分析条款

信息分析内容

标准信息分析

(需要基于良好的参考序列, 且每个样本拆分出的细胞数目上下浮动在20%或以内的误差皆属于正常范围)

1. 数据处理与质控分析

2. 免疫组库细胞克隆型分析

定制化信息分析

可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析内容


利用高通量单细胞免疫组库测序方法,揭示了登革热四价疫苗诱导的T细胞免疫机制。

文章: Dissecting the heterogeneity of DENV vaccineelicited cellular immunity using single-cell RNA sequencing and metabolic profiling

杂志: Nature Communications

影响因子: 12.124

样本/细胞类型:全血分离出来的PBMC,经过处理以及流式筛选后,分离出登革热病毒激活的记忆性CD8+ T细胞。

简要概述:

登革热病毒有四种不同的血清型,每年在世界各地感染多达2.8亿至5亿人,TAK-003是一种登革热四价减毒活疫苗。尽管很多感染登革热的病人很快从登革热感染中康复,但据报道仍有约50万人罹患严重的登革热,死亡率约为2.5%。如果病人感染一种血清型登革热,然后再感染另一种不同的登革热血清型,则发生严重疾病的可能性也会显著增加。这使登革热疫苗的研制更加复杂化,该疫苗需要诱导对所有四种血清型的保护性反应,并确保疫苗不会导致严重的登革热。

T细胞介导的特异性细胞免疫反应,是防治登革热和其他病毒性疾病的强有力且非常重要自身免疫反应;尽管疫苗可以诱导和扩增T细胞(机体适应性免疫系统的关键部分),但在决定T细胞反应的大小、多样性和持久性方面,目前的大部分的科学研究对其中的细节还不清楚。

本项研究结合了单细胞免疫组库分析与标准的免疫监测手段,发现了一种标记物,转铁蛋白受体1 (TfR1)可以鉴定CD8+细胞的分化潜能,这表明T细胞免疫依赖于特定的代谢物。基于发现的这系列转录特种,可定义一组标志物以判断最持久的疫苗反应性CD8+T细胞,以评估疫苗诱导的细胞免疫的程度、多样性和持久性等。

研究展示:

1. 对接种登革热疫苗14天后的临床样本的外周血单核细胞进行单细胞测序,发现了TCR克隆型存在高度多样性,以及接种疫苗获得的免疫记忆性CD8+T细胞亚群。

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图,TAK-003疫苗介导的CD38+HLA-DR+ CD8+T细胞是高度多克隆型和持续有长期活性的记忆细胞


2. 通过对临床接种了四联登革热疫苗第14天后的样本进行处理,分离其外周血得到CD8+T细胞后,再进行单细胞RNA-Seq表达量测序分析,发现了TfR1+HLA-DR+ or CD38+HLA-DR+CD8+ 的T细胞亚群,以及NS1或NS3激发的免疫CD8+T细胞亚群。 同时,对相同样本进行流式细胞分选后,也得到了相应一致的细胞亚群。

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图,疫苗介导的CD8+ T细胞跟TfT1因子的表达相关


1. 数据处理与质控分析

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2. 免疫组库细胞克隆型分析

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细胞状态

细胞直径<40μm;细胞活性>80%;细胞浓度>5×105/ml

细胞悬液背景干净,无大量结团、碎片及杂质,不含Ca2+Mg2+


Q1:冻存细胞/组织样本寄送前有哪些注意事项?

需要提前与当地销售经理沟通,提前告知邮寄到样时间,加快实验进程以及确保细胞样本活性。

Q2:癌症组织样本可以协助解离服务和上门建库服务吗?

可以进行癌症组织样本组织解离服务和上门建库服务。

Q3:华大提供的10X Genomics单细胞免疫组库产品是否可以只进行一种文库类型的建库?

10X Genomics单细胞免疫组库产品建库部分可分为TCR/BCR文库、TCR+BCR文库、TCR/BCR+5’mRNA文库、TCR+BCR+5’mRNA文库几种组合类型,客户可以根据自身研究需求选择所需的建库类型。


深圳华大科技(总部)

电话:400-706-6615
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