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基于BD Rhapsody高通量单细胞RNA-Seq

基于BD Rhapsody平台,实现高通量单细胞分选和单细胞mRNA建库,主要原理依据微孔法,实现高通量的单个细胞及无偏差3’端- mRNA捕获、扩增和检测,完成高效的mRNA反转录和扩增后进行高通量测序,结合华大DNBSEQTM高通量测序平台,实现单细胞基因表达研究,细胞类型解析,及细胞异质化研究等。针对合作伙伴提供的细胞,提供高质量细胞分选及RNA-Seq测序服务。


产品优势

  • 一次性获得高通量单细胞:细胞数量至多2万个,细胞分群更准
  • 实验质控严格:4次实时可视化监控,直观展现细胞捕获动态,有效保证实验成功率
  • 样本分选设计灵活:根据实验需求,单细胞多样本分选模式任您选择
  • 一站式单细胞解决方案配套:从目的细胞解离、富集、分选到流式分选细胞验证,一站式解决,避免细胞失活风险
  • 测序数据高保真:搭配DNBSEQ测序系统,不累计扩增错误,无数据拆分错误烦恼
  • 上门服务及时高质:仪器体积轻便,随项目而动*来自细胞系单细胞测序数据

产品类型

流式细胞分选搭载BD单细胞分选平台

  • 旗舰版:高通量单细胞分选模式——2万个单细胞/样本
  • 简约版:多样品低通量单细胞分选模式——5000个单细胞/样本(人、鼠免疫细胞)

* 以上版本均包含建库测序分析,细胞得数及数据量上下浮动20%,根据具体项目单细胞质量等问题,结果有差异


技术原理

基于BD Rhapsody平台的高通量单细胞RNA-Seq是结合微孔板技术,利用自然沉降的原理分离单细胞,将带有CL(Cell Label)、UMI(Unique Molecular Index,分子标签)、Poly-dT的磁珠与单细胞混合,从而实现大规模的单细胞mRNA捕获,以用于后续的文库构建。


图1 细胞分选&mRNA捕获原理示意图


实验流程

首先,将单细胞悬液加入BD Rhapsody™ cartridge(微孔板)中,通过随机分布和重力沉淀实现单细胞捕获;接下来,加入过量的磁珠加入到cartridge(微孔板)中,尽量使每个微孔中都有一个磁珠,以保证每个细胞都与一个磁珠配对;随后,随着细胞在微孔中裂解,mRNA分子被磁珠上的Oligo(寡核苷酸片段)捕获后,磁珠从微孔板中被收集到一个单独的试管中,用于随后的cDNA合成、文库构建。

 

两种产品模式实验流程如下:



测序策略

推荐DNBSEQTM平台测序,测序策略: PE75


信息分析流程

测序得到的原始数据称为Raw reads,之后会根据BD平台单细胞RNA-Seq独特的文库结构,对Reads的cell lable、 UMI 和插入片段部分进行拆分,之后插入片段部分将比对到参考基因组,然后统计比对到各个区域的比例,并进行表达量统计;基于表达量的结果,进行细胞时间轨迹预测,细胞聚类等分析,基于差异表达的结果,进行KEGG富集、GO富集、蛋白互作网络分析等。

表1 信息分析内容

信息分析条款

信息分析内容

标准信息分析

(需要基于良好的参考序列, 

且每个样本拆分出的细胞数目上下浮动在20%

或以内的误差皆属于正常范围

1. 测序结果统计

2. 数据质控统计

3. 比对结果统计

4. 基因表达定量分析

5. Marker基因鉴定

6. 细胞类型注释

7. 单样本/多样本细胞聚类分析

8. 特异marker基因差异分析

9. 样本间相同cluster基因差异分析

10. cluster差异表达基因GO功能分析

11. cluster差异表达基因Pathway功能分析

12. cluster差异表达基因TF编码能力预测

13. cluster差异表达基因蛋白互作分析

14. cluster基因相关性网络分析

高级信息分析

细胞轨迹分析(仅选取时间点样本可选做)

定制化信息分析

可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析内容。


交付周期

从样品复苏后,镜检符合上机要求、预付款到位开始(不包括由于样品等问题停滞时间以及试剂订购周期),细胞类型及生物信息分析整体完成周期视不同的类型而有所变化。

DNBSEQ平台

样品数≤8个,45个工作日(含建库、测序、标准信息分析)。

样品数≥9个,请单独咨询周期。


案例一:BD Rhapsody单细胞RNA-Seq应用案例解析-细胞分化[1]


发表杂志Nature methods

细胞类型:干细胞

发表时间:2018年12月

样本选择:

从13名健康受试者中收集15个hiPSC(human induced pluripotent stem cells,人类诱导的多功能干细胞)株系,将hiPSC株系定向诱导成hCS-FF(human cortical spheroids in feeder-free conditions,人类大脑皮层球状体)。


图1 将hiPSC诱导为hCS-FF的方案


结果展示:

 研究人员将3个hiPSC株系在平行分化的第105天(每个株系各自分化出了4-6个球状体,进行了混合)酶解成单细胞,活细胞比例约90%。通过BD Rhapsody平台,每个株系捕获到约1w个单细胞,随后对这些单细胞进行转录组测序和数据分析,结合之前同平台获得的hCS-MEF 和hSS-MEF单细胞转录组数据,构建了hiPSC分化第105天的转录图谱,最后获得了8个细胞亚群,也验证了hiPSC定向分化方法的可靠性。


图2 人类大脑皮层球状体单细胞特征


案例二:BD Rhapsody单细胞RNA测序鉴定半月板祖细胞并揭示半月板退变过程[2]


发表杂志Annals of the Rheumatic Diseases

样本选择:健康人半月板、退化半月板和小鼠半月板损伤模型

发表时间:2019年12月

样品选择:

将半月板组织(3个健康人)从滑膜上剥离,切成小块。利用4mg/mL的蛋白酶和2mg/mL胶原酶P先后对这些小块进行消化处理。

研究结果:

1. 研究人员利用BD Rhapsody平台,以半月板细胞为样本进行了单细胞RNA测序,根据单细胞转录组数据的分析,从健康人半月板中分离出7个细胞亚群,其中包括2个新的细胞群:(1)内皮细胞(EC,表达CD93和CDH5)、(2)软骨干细胞(CPC,表达CDK1和BIRC5)、(3)调节性软骨细胞 (Reg C,表达BMP2和FOSL1)、(4)纤维软骨细胞 (FC,表达COL1A1、COL3A1和COL6A1)、(5)增生前软骨细胞 (PreHTC,表达MMP1和TNFAIP6)、(6)纤维软骨细胞干细胞(FCP,同时表达纤维软骨细胞基因 COL1A1和COL3A1以及间充质干细胞标记基因MCAM和MYLK)、(7)增殖纤维软骨细胞 (ProFC, 表达纤维软骨细胞基因COL1A1和生长因子FGF7和CTGF)。


图3 健康人体半月板单细胞图谱

2. 研究人员为了研究FCP向亚群的分化和相应的基因表达,选择FCP、 ProFC、FC、PreHTC和RegC构建了模拟的细胞轨迹,其中包含对应于两个不同细胞轨迹的末端;还评估了在FCP分化过程中细胞的基因表达。结果表明,表达模式与两种不同的轨迹相一致,也就是单细胞RNA测序分析与半月板的发育过程相关。


图4 细胞轨迹

3. 研究人员将健康人群半月板细胞和退化半月板细胞单细胞RNA测序结果在t-SNE进行对比分析。结合基因表达分析结果,发现DegP细胞群主要分布在退化半月板中,DegP是半月板退化的关键因素。


图5 健康人群半月板和退化半月板对比结果

参考文献:

[1] Yoon, SJ., Elahi, L.S., Pașca, A.M. et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nat Methods 16, 75–78 (2019). https://doi.org/10.1038/s41592-018-0255-0

[2] Sun H, Wen X, Li H, et al Single-cell RNA-seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration. Annals of the Rheumatic Diseases 2020;79:408-417. 



样本要求

类型

组织:人、鼠、新鲜及梯度冻存组织

细胞:PBMC、细胞系,组织解离细胞等

细胞状态

细胞直径<=25μm最佳,小于50um均可以尝试;细胞活性>70%;细胞浓度200-800/μL,推荐送样>=最低细胞总量 105个。

细胞悬液背景干净,无大量结团、碎片及杂质,不含Ca2+Mg2+


Q1:BD平台捕获原理是什么? 此种分选的优势是什么?

A1:细胞的自然沉降,可以减少细胞损伤,对低活率的细胞容忍度高。有数据支持,低活率细胞样本结果与捕获预期基本一致。提高项目的启动率。如果是50%低活率,做10X平台分选,死细胞成接团状态或者细胞碎片状态,就容易出现堵孔的情况,造成实验失败。

Q2:低活率细胞上BD分选实例?

A2:如下截图,活率58.66%,上样24000个细胞,其中活细胞14078个,分选后数据分析结果显示, 得到有效细胞为8343个。



Q3:细胞数量重要还是检测到的基因数重要?

A3:2019 年 发 表 在 Circulation 上 的 文 章“Single-Cell Analysis of the Normal Mouse Aorta Reveals Functionally Distinct Endothelial Cell Populations”在设计实验室 比较了不同测序深度对细胞聚类的影响,4 个主动脉样本中,2 条主动脉样本测序深度低 (17,000 reads/cell),2 条主动脉样本测序深度高 (145,000 reads/cell),分析得到的细胞数量二者之间无差异。且从不同测序深度来评估分群准确度的影响,当测序深度达到 2.5K reads/cell 时,细胞类型分类准确度达到 98% 并且相对一致。且增加单个细胞的测序深度,细胞类型分群准确度提升不明显。


综合测序数据量和细胞数,可知在低细胞数情况下,随着测序深度增加,细胞类型分类准确度依然维持在较低水平,但在低测序深度情况下,细胞类型分类准确度可以随细胞数量增加而增加,表明细胞数对细胞类型分类准确度的影响大于测序深度。

Q4:非人、鼠样本,可以用SMK试剂标记进行pooling分选操作吗?

A4: 不能,目前SMK试剂盒是有两种:人的全类型细胞SMK试剂盒和小鼠免疫细胞SMK试剂盒。

Q5:BD平台WTA文库插入片段大小及文库结构?

A5:如图所示,插入片段大小200-400bp;cell lable 是52bp; UMI是18bp。



Q6:测序策略推荐?

A6:测序策略是PE75,主要原因是BD软件识别75bp序列进行分析,同10x平台软件一样识别91bp分析一样。

Q7:WTA、TTA 以及SMK 全称?

A7: WTA:whole transcriptome analysis

TTA:Targeted  Transcriptome analysis

SMK:Single-Cell Multiplexing Kit

Q8: 是否可以进行细胞核的分选?

A8: 从原理上可以尝试,测试效果未知;可以尝试。

Q9: 物种类型?

A9: 人、鼠、 哺乳类动物细胞可以尝试;植物样本暂时不接。

Q10:Scanner 可以进行四次质控的重要作用?

A10:可以实现实时监控,保质保量;如发现问题,可以及时调整和终止,节省成本。


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