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蛋白鉴定分析
蛋白鉴定分析，利用质谱技术对细胞、组织、体液或经过分离、纯化、富集后的蛋白胶/液等类型样本中全部或特定的蛋白进行种类鉴定，充分了解特定环境下蛋白质种类情况是进行蛋白质组学研究的基础，为研究疾病发生发展过程以及动植物生长发育状态提供直观的蛋白质种类鉴定结果。蛋白质鉴定分析类产品按研究对象和内容的不同，可分为以下两个产品：蛋白全谱分析和胶点/胶条鉴定。
蛋白全谱分析
蛋白全谱分析是对蛋白质组的整体分析方法，通过质谱手段能得到尽可能多的蛋白质信息。主要用于对未知样品中含有的蛋白质种类进行全面的分析。基于质谱技术的蛋白全谱分析，可以为蛋白质高通量的定量和修饰分析提供参考信息。此外，结合全谱分析数据和转录组数据，可以相互补充并共同验证基因注释及功能信息。
胶点分析
双向电泳得到蛋白质图谱，用相关软件分析得到差异或感兴趣的蛋白质点，使用质谱技术对其进行鉴定，得到蛋白质的详细信息。
胶条/蛋白液分析
SDS-PAGE胶中分离出的指定条带或较少组分（一百以内）蛋白液进行质谱鉴定。
图1 胶点（左）胶条（右）图
产品优势
- 仪器精准：基于高分辨率（大于105）、高质量精度（小于1ppm）质谱平台，确保鉴定结果准确性。
- 高鉴定性：系统全面地研究组织或细胞中尽可能多的蛋白质，可鉴定多达6000种蛋白。
- 适用范围广：无物种特异性限制，理论上可用于所有物种。
产品应用
- 疾病发生发展过程中的蛋白表达调控机制
- 动植物生长发育机制研究
- 抗逆抗病机制研究
技术路线
图1 蛋白全谱、胶条和胶点鉴定的技术路线（其中胶点鉴定不含有绿色方块中的分析步骤）
信息分析内容
信息分析条款 | 信息分析内容 |
标准信息分析 | 1.1 数据产出统计 1.2 蛋白质鉴定结果 1.3 蛋白质GO分析（仅适用于全谱分析和胶条鉴定） 1.4 蛋白质CCOG/KOG分析（仅适用于全谱分析和胶条鉴定） 1.5 蛋白质Pathway代谢通路分析（仅适用于全谱分析和胶条鉴定） |
个性化信息分析 | 2.1 单个样本蛋白质相对丰度定量（iBAQ）（仅适用于全谱分析和胶条鉴定） |
定制化信息分析 | 3.1 可结合客户需求，协商确定定制化信息分析服务内容。 |
1、基于质谱技术对人脑组织中血脑屏障相关蛋白进行鉴定
Identification of Blood−Brain Barrier-Associated Proteins in the Human Brain. J. Proteome Res. 2020
背景：
血脑屏障（BBB）对大脑稳态至关重要，它控制着分子进出大脑的选择性通道。尽管血脑屏障在各种脑部疾病中起着至关重要的作用，并且与药物的开发有关，但对其分子结构知之甚少。特别是星形细胞端足与内皮细胞之间基底层的组成目前还不完全清楚。
实验设计：
7例未患脑部疾病尸检病例的FFPE额叶皮质组织块，分别采集脑内微血管、蛛网膜下腔蛛网膜血管和血管周围脑组织三种类型的样本，共计21例样品，进行LC-MS/MS蛋白全谱鉴定。
主要结果：
通过显微解剖对样品进行纯化，之后使用鸟枪蛋白质组学提供了血脑屏障中鉴定到的蛋白质列表。随后的免疫组化详细描述了这些蛋白各自的表达位点。证实膜蛋白MLC1和磷酸葡萄糖酶相关蛋白5（PGM5）在血脑屏障中特异性存在。鉴定出的蛋白在血脑屏障功能中的作用有待进一步研究。
图1 BBB相关蛋白研究流程
2、ABCA4对创伤性增殖性玻璃体视网膜病变影响的蛋白质组学研究
Proteomic evidence that ABCA4 is vital for traumatic proliferative vitreoretinopathy formation and development. Experimental Eye Research, 2019.
背景：
增生性玻璃体视网膜病变（PVR）是视网膜脱离衰竭的主要原因。PVR发展的机制复杂，目前尚未完全阐明，至今仍没有有效的早期预防及临床治疗的方法。在整个PVR疾病过程中，视网膜蛋白呈现异常表达，但由于研究方法和技术的局限性，现在对PVR中视网膜蛋白的变化仍未完全解析。本课题通过SDS-PAGE与质谱联用的技术，系统地分析和鉴定了PVR和非PVR（正常）眼的视网膜之间的差异蛋白质表达。
实验思路：
- 从9名患有创伤性PVR视网膜脱离的患者中收集的视网膜样本
- 通过LC-MS/MS对样品进行分析得到总蛋白鉴定结果
技术路线：
提取总蛋白——SDS-PAGE——切取胶条——质谱检测——MaxQuant蛋白组学信息分析——后续验证
主要结果：
1）共鉴定到3,518种蛋白，差异表达蛋白数量为247。
2）ABCA4是PVR中差异表达最多的蛋白质之一，与对照组（眼睛健康的患者组）相比，ABCA4在PVR标本中显著上调。
3）ABCA4下调导致RPE细胞周期停滞在G0/G1期，从而抑制RPE细胞增殖和迁移，促进RPE细胞的凋亡。
图2 实验组和对照组中，ABCA4表达情况
A. 通过qRT-PCR测定ABCA4 mRNA表达；B. 通过蛋白质印迹测定ABCA4蛋白质水平
1. 标准信息分析
1.1 蛋白鉴定结果
蛋白鉴定结果表包含每个样品鉴定到的蛋白具体信息，包括蛋白分组号、蛋白ID号、相对分子质量、等电点、描述信息、鉴定覆盖率、鉴定肽段数、鉴定谱图数以及匹配相同肽段的蛋白质ID。
表1 鉴定蛋白列表
Sample | Total_spectra | Identified_spectra | Identified_peptides | Identified_proteins |
Jurkat | 88053 | 43657 | 16708 | 5129 |
1.2 蛋白功能注释分析
对鉴定到的蛋白，华大提供GO功能注释分析，COG/KOG注释分析和KEGG Pathway注释分析等分析内容。
图1 GO功能注释（左图），COG注释结果统计（右图）
GO分类图显示了三个本体中所涉及到各条目的分布情况，不同颜色标记为三个本体中涉及到的各个条目
1. 蛋白胶点胶条送样要求
表1 蛋白胶点胶条送样要求
样品类型/ | 胶点鉴定 | 胶条鉴定 |
考染、银染胶点/胶条 | 肉眼可见斑点 | ≥1μg蛋白 |
单个蛋白（针对IP、Co-IP纯化获得的蛋白液） | / | ≥5μg，浓度≥0.5μg/μL |
注：银染胶不能含用戊二醛；尽量送考染样品，银染可能存在假阳性；且保证在电泳后一周内进行切胶送样
2. 蛋白全谱送样要求
表2 蛋白全谱送样要求
| 样品类型 | 送样量 | 备注 |
| 新鲜动物组织干重 | ≥10mg | |
| 植物和蕈类真菌（如蘑菇、木耳）类样品量湿重 | ≥500mg | 植物的种子和果实分别含淀粉和糖分较高，为避免提取的蛋白总量不达标需再次送样浪费周期，送样时尽量送2g以上。 |
| 酵母、霉菌类真菌和细菌、噬菌体等微生物 | ≥50mg，或细胞数≥5×106 | |
| 新鲜培养细胞数(个) | ≥1×107 | |
| 客户分离好的外泌体 | ≥100μg，浓度≥0.5μg/µL | |
| 血液类（去高丰度） | 血清、血浆≥200µl | 解冻后血细胞会破裂，蛋白溶出来会影响分析，因此一般不建议送全血。 |
表3 蛋白类样品送样要求
| 样本类型 | 送样量 |
| 蛋白液 | ≥200μg，浓度≥0.5µg/µL |
Q1：蛋白全谱分析鉴定数能达到多少？
A1：蛋白全谱分析鉴定到的蛋白数，与物种、样本中蛋白质含量及复杂程度、实验中蛋白组分分离程度、数据库的完整度都有很大的关系。如植物来源的样本中蛋白质种类通常比动物来源的样本多，动物组织样本中蛋白质种类通常比其血液样本多。一般情况下，一次全谱分析可以鉴定到7000个左右的蛋白种类。
Q2：双向凝胶电泳与质谱联用鉴定蛋白质的过程是什么？
A2：通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，进行谱图差异分析，找到差异点。把差异点切出，进行脱色、酶解、质谱检测，得到质谱原始数据文件，通过数据库搜索可以得到差异点中的蛋白质的详细信息。
Q3：华大可以对Co-IP获得的蛋白质进行鉴定吗？
A3：可以，这属于我们的标准产品“非胶条鉴定”，建议直接将IP后洗脱下来的蛋白液送样，无需跑胶切胶，如果洗脱后蛋白液体积较大，蛋白浓度较低，建议浓缩后送样。
Q4：Co-IP后蛋白液添加了loading buffer并经煮沸处理，可以鉴定吗？
A4：可以，在送样登记表中注明此情况并添加loading buffer成分即可。
