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UMI Small RNA 测序

        UMI Small RNA测序,文库构建时引入特异性分子标签(UMI),结合高通量测序,研究某物种某组织在特定时空状态下18-30 nt的small RNA片段序列信息,实现绝对定量,通过与数据库比对, 可实现small RNA序列的鉴定、预测、靶基因分析和功能分析, 以及包含miRNA、siRNA、piRNA等多种small RNA类型的分析研究需求等。主要应用在动植物生长发育调控研究、抗病抗逆调控研究、生物性状及突变调控研究等;在疾病研究方面,可研究疾病发生调控机制、寻找生物标记、靶向药物研究等。

技术优势

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研究内容

        利用BGISEQ平台,对富集到的18-30nt的小RNA片段进行测序,对获得的有效数据进行序列长度分布统计,将筛选后的高质量序列分类注释,从而获得样品中包含的各组分及表达量信息,并对所有小RNA片段进行注释,对miRNA进行靶基因预测等分析。

一、标准分析

1、数据产出统计,对原始信息采集数据去接头污染,去低质量reads         

2、18-30 nt Small RNA 信息采集结果的长度分布         

3、Small RNA在选定的参考基因组上的分布(只能选定一个参考基因组)

4、Small RNA分类注释

①Small RNA与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比对信息   

②Small RNA与重复序列的比对信息

③Small RNA与exon/intron的比对信息    

④Small RNA与miRBase中指定范围的已知的miRNA的比对

⑤miRNA家族分析

⑥动物保守piRNA注释分析(分析仅针对数据库中已有的物种:人、小鼠、斑马鱼、线虫、果蝇、大鼠、鸡、家蚕)

5、Small RNA预测(miRNA/siRNA/piRNA)

6、已知和新Small RNA 定量分析(miRNA/siRNA/piRNA)

7、已知和新Small RNA差异表达分析(miRNA/siRNA/piRNA)

8、已知和新miRNA表达/差异表达聚类分析

9、Small RNA 靶基因预测(miRNA/siRNA/piRNA)

10、差异Small RNA 靶基因GO 注释和KEGG 通路分析

二、高级分析

1、差异miRNA与差异靶基因的相关性分析;

2、差异miRNA与差异靶基因互作网络绘制;

3、互作靶基因功能富集分析(KEGG和GO);

三、定制化信息分析

可结合客户的材料与需求,协商确定定制化信息分析内容。


疾病miRNA表达谱——microRNA分析揭示IL1途径在风湿性心脏瓣膜病中潜在增强

Comprehensive microRNA profiling reveals potential augmentation of the IL1 pathway in rheumatic heart valve disease[J]. BMC cardiovascular disorders, 2018, 18(1): 53.

研究摘要

        心脏瓣膜病是心血管病死亡的主要原因,中国尤甚,超过一半的心脏瓣膜病是由急性风湿热引起,但心脏瓣膜病的miRNA谱未知。本次研究采用4例风湿性心脏病患者(2例中度,2例重度)和1例健康人对照的血清样本进行高通量测序,患者中共有的下调miRNA 91个,上调miRNA 13个。进行靶基因和功能预测后,选取9个miRNA利用qRT-PCR做大样本验证。在40例患者(20例中度,20例重度)和20例健康人中,发现2个miRNA(hsamiR-205-3p和hsa-miR-3909)分散度低,风湿性心脏病患者显著降低,先天性心脏病患者与健康人无明显改变。预测hsamiR-205-3p靶向IL-1β,hsa-miR-3909靶向IL1R1,并利用荧光素酶测定验证miRNA抑制靶基因表达。免疫组化测定靶基因编码蛋白的表达量,得出在风湿性心脏病患者中比在先天性心脏病患者中IL-1β、IL1R1 的表达量更高。

研究结果

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图1  患者中共有的91个下调miRNA、13个上调miRNA靶基因功能分析。

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图2  9个miRNA利用qRT-PCR进行大样本验证。

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图3  IL-1β、IL1R1在风湿性心脏病患者中比在先天性心脏病患者中表达量更高。

 

 miRNA机制研究——寄生昆虫衍生的miRNA调节宿主发育

Parasitic insect-derived miRNAs modulate host development[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 2205.

研究摘要

        寄生蜂会产生毒液、多DNA病毒(PDV)、畸形细胞等,改变宿主的生理状态有益于后代存活,但改变的潜在分子机制仍不清楚。本研究发现寄生蜂(C. vestalis)的畸形细胞、多DNA病毒(嵌入到寄生蜂基因组中特有的共生病毒)CvBV可以产生miRNA并通过不同方式将其传递到宿主中。寄生宿主小菜蛾(P. xylostella)中某些miRNA主要由畸形细胞产生,而寄生宿主中由CvBV编码的miRNA的表达水平比非寄生宿主高100倍。一种畸形细胞产生的miRNA(Cve-miR-281-3p)和一种CvBV产生的miRNA(Cve-miR-novel22-5p-1)通过调节宿主蜕皮激素受体(EcR)的表达来阻止宿主生长。研究结果显示miRNA在动物寄生中可以进行跨物种调控,及寄生期间宿主生理改变中miRNA的功能。

研究结果

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图1  寄生蜂幼虫和畸形细胞中的miRNA 特征

比对寄生蜂的基因组得到20个由多DNA病毒编码的miRNA,由13个前体miRNA剪切加工形成。

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图2  CvBV编码的miRNA在CvBV感染的宿主小菜蛾中的表达。

i.小菜蛾三龄幼虫注射CvBV;j. CvBV加入细胞培养基中进行细胞感染。

RT-qPCR验证20个miRNA,其中17个miRNA可以验证。

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图3  RT-qPCR结果表明畸形细胞会释放出特异的miRNA

验证发现畸形细胞所编码的miRNA必须分泌到胞外,并被寄主小菜蛾的血细胞所吸收才能起作用。

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图4  Cve-miR-281-3p和Cve-novel22-5p延迟小菜蛾的生长和化蛹。

对畸形细胞中30个高表达miRNA进行靶基因预测,选择具有同一靶标基因(EcR)进行功能验证。RT-qPCR和免疫印迹检测转录本丰度和蛋白质表达丰度。畸形细胞源的miRNA和CvBV源的miRNA都能作用于寄主小菜蛾蜕皮激素受体(EcR),下调寄主EcR的表达水平及蛋白水平,延迟小菜蛾的蜕皮和化蛹。


af_Life_UMI3

图1  小RNA分类注释

通过与已知的sRNA数据库比对,鉴定小RNA,各类小RNA所占比例。

miRNA

图2  差异表达miRNA   

X轴代表比较组,Y轴是对应的小RNA数。绿色代表下调,红色代表上调。

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图3  差异miRNA火山图

图中X轴表示差异倍数取log2的值,Y轴表示-log10(FDR),绿色的点表示显著下调的sRNA,红色的点表示显著上调的sRNA。

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图4  差异表达小RNA层次聚类

X轴代表进行聚类分析的差异比对,Y轴代表差异基因。颜色代表差异倍数(颜色越红代表表上调倍数越大,越绿代表下调倍数越大)。

af_QIA-vs-af_Life_DEGseq

图5  KEGG通路注释分类统计图

横坐标为差异小RNA的靶基因个数,纵坐标表示二级KEGG pathway通路。二级通路又分别属于不同的一级通路,图中用不同颜色表示一级通路类别。


表1  Small RNA组织样品送样建议

组织类型

具体要求

新鲜培养细胞(细胞数)

≥2×105cell

新鲜动物组织干重

≥30mg

新鲜植物组织干重

≥100mg

全血

≥ 1 mL全血收集的淋巴细胞

≥ 1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect® Animal Blood Tubes收集的全血

菌体 (细胞数或干重)

≥2×105cell or ≥30mg

FFPE

≥ 5片,未染色,100 mm2,5 ~ 10μm厚度

表2  Small RNA测序样品判定标准

样本类型

总量

浓度

RIN

28S/18S

基线和5S

纯度

Total RNA (Plant / Fungi)

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥7.5

28S/18S≥1.3

基线平整,5S峰正常

无DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

Total RNA (Animals)

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥8.0

28S/18S≥1.5

Total RNA (Prokaryotes)

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥8.0

23S/16S≥1.5

FFPE RNA

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥2.0

DV200≥30%

Total RNA (Insect)

≥1μg

≥50ng/μL

N/A

Small RNA(<200nt)

≥100ng

≥5ng/μL

N/A

N/A

Small RNA of Plasma/serum

≥20ng

≥2ng/μL

N/A

N/A

 


Q1:小 RNA 测序对样品提取有什么特殊要求? 

        提取总RNA时建议不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒,也不要使用LiCl沉淀,以免丢失小片段RNA。如果直接提供small RNA样品,可以使用small RNA提取专用试剂盒来进行提取。

Q2:华大可以实现什么类型的样品建库测序?

         动植物总RNA样品、微生物总RNA样品、200nt以内的小片段RNA样品、经切胶回收的small RNA样品、组织培养与细胞系样品、血清/血浆样品、组织液样品,FFPE样品、RIP样品,外泌体样本等,只要满足华大送样要求,均可在华大用于小RNA建库测序。

Q3:为什么实验结果中会存在降解的 rRNA序列? 

        由于 total RNA 常发生轻微的降解,而生物体内也有自然的降解过程,因此数据中就会含有小部分 mRNA 降解片段。但通常这个比例很低,并且取决于样品 total RNA 的质量。

Q4:进行小 RNA 测序时,客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息? 

        需要提供相应物种的基因组和相关的 exon、intron、repeat 信息。如果没有本物种的基因组,需要提供近缘物种的相关信息。 


 


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