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UMI Small RNA 测序

        UMI Small RNA测序,文库构建时引入特异性分子标签(UMI),结合高通量测序,研究某物种某组织在特定时空状态下18-30 nt的small RNA片段序列信息,实现精准定量,通过与数据库比对, 可实现small RNA序列的鉴定、靶基因分析和功能分析, 以及包含miRNA、siRNA、piRNA等多种small RNA类型的分析研究需求等。主要应用在动植物生长发育调控研究、抗病抗逆调控研究、生物性状及突变调控研究等;在疾病研究方面,可研究疾病发生调控机制、寻找生物标记、靶向药物研究等。

技术优势

1.  实验方法升级,数据库更新,sRNA定量结果更可靠

建库引入UMI技术,实现无偏向的精确定量,矫正原有70%的reads定量偏差;采用权威最新miRBase数据库、KEGG数据库;

2.  实验技术经验丰富,低起始量成功率高,技术重复性高

已完成350多种不同物种的项目,常规样本单次建库只需100ng,血清血浆样本只需20ng;小RNA样本实现最低1 ng起始量;低起始量建库成功率达95%;建库、测序技术重复性高;

3.  多样的样品类型,满足多角度研究需求

接收除常规样品以外的血清、血浆样品、组织液样品、FFPE样品、外泌体、RIP富集RNA等多种类型;

4.  Dr.Tom系统交付,多种个性化分析任您选

采用Dr.Tom多组学数据挖掘系统,10大数据库注释,多维度结果图片展示,数据图表循环挖掘;

5.  无忧解决售后

可根据客户需求进行贴身个性化服务,为文章撰写提供技术服务。

研究内容

        利用DNBSEQ平台,对富集到的18-30nt的小RNA片段进行测序,对获得的有效数据进行序列长度分布统计,将筛选后的高质量序列分类注释,从而获得样品中包含的各组分及表达量信息,并对所有小RNA片段进行注释,对miRNA进行靶基因预测等分析。


标准信息分析

1.  数据产出统计,对原始信息采集数据去接头污染,去低质量reads

2.  small RNA 信息采集结果的长度分布

3.  small RNA在选定的参考基因组上的分布

4.  small RNA分类统计

5.  miRNA定量分析

6.  miRNA差异表达分析

7.  miRNA表达/差异表达聚类分析

8.  miRNA靶基因分析

9.  差异miRNA 靶基因GO 注释和KEGG 通路分析

高级信息分析

一)数据库注释

1. 转录因子注释(AnimalTFDB/PlantTFDB)

2. GSEA分析

3. Rfam、Pfam、Reactome、COG、EggNOG和InterPro数据库注释

二)互作网络分析

1. 靶基因分析

① miRNA-mRNA靶向关系分析

② lncRNA-mRNA靶向关系分析

2. ceRNA互作网络分析

3. 蛋白互作网络分析

4. 共表达互作网络分析

三)特色分析

1. 外部数据库关联分析(TCGA、ARCHS4)

2. 关键驱动基因网络图分析


疾病miRNA机制研究——血小板来源外泌体促进败血性休克中性粒细胞胞外陷阱的形成

Platelet-derived exosomes promote neutrophil extracellular trap formation during septic shock. Crit Care. 2020 Jun 29;24(1):380. 

研究摘要

       血小板已被证明是败血症期间中性粒细胞胞外陷阱(NET)形成的有效激活剂,并且主要来源于血小板的循环血浆外泌体可能在败血症期间诱发血管凋亡和心肌功能障碍,但血小板源性外泌体在NET形成中的作用以及与人类血小板介导NET产生有关的介体和分子途径仍不清楚。本次研究通过构建体内体外败血症模型,探究血小板源性外泌体在败血性休克过程中NET形成中的作用及其潜在机制。

       结果显示,NET成分(dsDNA和MPO-DNA复合物)在败血性休克患者血液中的外泌体中显著增加,并且与疾病的严重程度和预后呈正相关。在动物体内模型中,减少血小板可降低血浆外泌体浓度,NET形成以及肺损伤。机制研究表明,外泌体高迁移率族蛋白1(HMGB1)和/或miR-15b-5p和miR-378a-3p通过Akt / mTOR自噬途径诱导了NET的形成。

研究结果


图1 NET形成的增加与败血性休克期间的死亡率和严重程度有关



图2 外泌体miR-15b-5p和miR-378a-3p通过靶向PDK1促进NET的形成


 

miRNA调控机制研究——MiR396-GRFS介导油菜素类固醇对拟南芥幼苗去黄化过程中光氧化损伤的保护作用

The miR396-GRFs Module Mediates the Prevention of Photo-oxidative Damage by Brassinosteroids during Seedling De-Etiolation in Arabidopsis. The Plant Cell Aug 2020, 32 (8) 2525-2542;

研究摘要

       从暗到光的转化对于幼苗的存活和生长至关重要,但是其潜在的调控机制仍不完善。植物生长发育所必需的一类植物甾体激素——油菜素甾体(BRs)和植物特异性转录因子——生长调节因子(GROWTH-regulation FACTORs,GRFs),二者在植物生长发育调控中发挥重要作用。

       结果表明,油菜素甾体缺陷型det2-1突变体的黄化幼苗在光照下积累了过量的原叶绿素,导致光氧化损伤。相反,获得性功能突变体bzr1-1D抑制det2-1的原叶绿素积累,从而促进黄化幼苗的绿化。此外,研究发现BZR1和PIF4诱导生长调节因子GRF7和GRF8抑制叶绿素的生物合成,促进幼苗的绿化。过表达microRNA396a抑制GRFs功能会在黑暗中引起原叶绿素的积累,并且在曝光后会发生严重的光漂白,BZR1,PIF4和GRF7相互作用,精确调控叶绿素生物合成基因的表达。

研究结果


图1 油菜素提高了暗生苗的返青率



  图2 miR396和GRFs在黄化苗返青中起重要作用



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图1  小RNA分类注释

通过与已知的sRNA数据库比对,鉴定小RNA,各类小RNA所占比例。


图2  差异表达miRNA聚类热图   



图3  差异miRNA与差异靶基因关联聚类图



图4  差异表达miRNA与差异靶基因互作网络图


表1  Small RNA组织样品送样建议

组织类型

具体要求

新鲜培养细胞(细胞数)

≥2×105cell

新鲜动物组织干重

≥30mg

新鲜植物组织干重

≥100mg

全血

≥ 1 mL全血收集的淋巴细胞

≥ 1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect® Animal Blood Tubes收集的全血

菌体 (细胞数或干重)

≥2×105cell or ≥30mg

FFPE

≥ 5片,未染色,100≥ 5片,未染色,100 mm2,5 ~ 10μm厚度


表2  Small RNA测序样品判定标准

样本类型

总量

浓度

RIN

28S/18S

基线和5S

纯度

Total RNA (Plant)

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥7.0

28S/18S≥1.3

基线平整,5S峰正常

无DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

Total RNA (Animals)

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥8.0

28S/18S≥1.5

FFPE RNA

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥2.0

DV200≥30%

Total RNA (Insect)

≥1μg

≥50ng/μL

N/A

Small RNA(<200nt)

≥100ng

≥5ng/μL

检测峰集中在200nt以内

N/A

Small RNA of Plasma/serum

≥20ng

≥1ng/μL

检测峰主要集中在200nt-500nt以内 

N/A


Q1:小 RNA 测序对样品提取有什么特殊要求? 

        提取总RNA时建议不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒,也不要使用LiCl沉淀,以免丢失小片段RNA。如果直接提供small RNA样品,可以使用small RNA提取专用试剂盒来进行提取。

Q2:华大可以实现什么类型的样品建库测序?

         动植物总RNA样品、微生物总RNA样品、200nt以内的小片段RNA样品、经切胶回收的small RNA样品、组织培养与细胞系样品、血清/血浆样品、组织液样品,FFPE样品、RIP样品,外泌体样本等,只要满足华大送样要求,均可在华大用于小RNA建库测序。

Q3:为什么实验结果中会存在降解的 rRNA序列? 

        由于 total RNA 常发生轻微的降解,而生物体内也有自然的降解过程,因此数据中就会含有小部分 mRNA 降解片段。但通常这个比例很低,并且取决于样品 total RNA 的质量。

Q4:进行小 RNA 测序时,客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息? 

        需要提供相应物种的基因组和相关的 exon、intron、repeat 信息。如果没有本物种的基因组,需要提供近缘物种的相关信息。 


 


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