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蛋白 DIA 定量分析
蛋白定量DIA产品，主要采用数据非依赖性采集模式（data independent acquisition，DIA），通过液质联用技术（LC-MS/MS）对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，结合传统的数据依赖性采集模式（data dependent acquisition，DDA）构建的谱图库，可对蛋白质组进行鉴定、定量，获得肽段、蛋白及所属物种来源、蛋白表达量变化等信息。
产品优势
蛋白定量DIA技术，采用全景式数据采集模式，效果对比下：
图1 HRM（DIA）vs Shotgun proteomics（DDA）
图中横坐标是分组的样本编号，纵坐标是蛋白质种类，该图展示的是各样本中，不同质谱采集模式下，蛋白质峰强度情况。其中DIA比DDA的峰强度覆盖度更好，偏向性较小；DDA缺失值较多，并且对高丰度肽段有偏向性。
- 鉴定数高：鉴定数提高30%；一针组织样本鉴定数可达7000+
- 重复性好：技术重复性提高30%，可达90%
- 定量准确性好：通过二级谱峰面积定量，大项目质控CV低至25%
- 质控完善：加入iRT校正；QC样本重复性CV<30%的比例大于67％
- 周期短：实际样本上机不分组，提高结果重复性的同时，压缩周期3倍以上
- 费用低：降低费用3倍以上
产品应用
技术路线
信息分析内容
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信息分析条款 |
信息分析内容 |
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标准信息分析 |
1 谱图库构建 1.1 数据产出统计 1.2 谱图库鉴定结果 2 标准信息分析内容 2.1 数据产出统计 2.2 数据质控（组内变异系数、主成分分析以及样本定量相关性） 2.3 蛋白质鉴定和定量结果 2.4 蛋白质GO分析 2.5 蛋白质COG/KOG分析 2.6 蛋白质Pathway代谢通路分析 2.7 差异蛋白的GO富集分析 2.8 差异蛋白COG/KOG富集分析 2.9 差异蛋白的Pathway富集分析 2.10 重复性分析（仅针对设计了重复的实验） 2.11多样品间表达模式聚类（三个或三个以上样品可提供） 2.12 时间序列分析 2.13 差异表达蛋白互作分析 2.14 差异表达蛋白亚细胞定位 |
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定制化信息分析 |
3 蛋白质组与转录组/RNA-seq表达量关联分析 3.1 关联数量统计 3.2 表达量关联分析
3.3 GO富集关联分析
3.4 Pathway富集关联分析
3.5 差异蛋白与差异基因整合分析 3.6 差异蛋白及差异基因互作网络图 3.7 转录因子的关联分析
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1、DIA技术对胸腺上皮肿瘤进行分子分型研究
Deciphering tissue-based proteome signatures revealed novel subtyping and prognostic markers for thymic epithelial tumors. Mol Oncol. 2020
背景：胸腺上皮肿瘤（TETs）很少发生，但机制尚未研究清楚，而且临床上存在很高的异质性，需要寻找具有高敏感性和特异性的生物标志物来精准区分TET患者，并做预后管理。
实验设计：
研究选取了134个冰冻样本（84个肿瘤、40个癌旁、10个正常胸腺），其中90个样本进行DIA分析，发现不同TET亚型之间新的分子分型；为了进一步确认感兴趣的蛋白，在剩余的44个样本当中进行PRM和IHC分析和成像分析。
图1 研究流程
主要结果：
1. 90个DIA，总共量化了3200+蛋白。肿瘤样本中鉴定3000+蛋白，癌旁和正常组织鉴定2500-2800个蛋白。通过聚类分析发现癌旁与正常组织之间的蛋白质表达模式相似，与胸腺瘤和胸腺鳞状细胞癌（TSCC）样本的蛋白质表达模式显著不同，可能是由于老年人病变组织中脂肪占主导地位导致的。
2. A型与B型胸腺瘤的分子特征，A型与B型之间的差异蛋白有155种。差异蛋白的主要生物学功能与细胞运动、白细胞生成和淋巴细胞数量相关。PRM验证中选择7个候选蛋白，包括ACOT7、BCAM、FYB1、galectin-3/9、GRAP2和NKCC1；免疫组化选择了3个蛋白NKCC1、CK19、TdT验证，结果与DIA结果一致。
3. 研究还发现CNOT2/9和SHMT1对胸腺瘤和TSCC具有很好的区分能力，有助于提高当前临床对胸腺瘤不同亚型的诊断及分型的准确性。
图2 目标蛋白验证结果
A．CNOT2 / 9、SHMT1、CK19和TdT的免疫组化结果；B. 胸腺瘤和TSCC样品中验证蛋白的免疫组化半定量评分；C. 对CNOT2和SHMT1的免疫荧光结果
2、DIA技术筛选银屑病严重程度和中药疗效的血清生物标志物
In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicine. Theranostics. 2019
背景：银屑病是一种常见免疫介导的炎症性皮肤病，其特征是皮肤和关节损伤，且伴有并发症，有病程长、难治疗、易复发等特点。该病发病机制复杂，受遗传因素和环境因素双重影响。此外，银屑病患者对治疗反应不同，但机制尚不清楚。
实验设计：
前期生物标志物筛选阶段（发现集），设置三组样品，健康对照组16例健康人血清、银屑病患者组23例患者血清、银屑病治疗组为11例经12周银屑病治疗的患者血清。后续验证阶段（验证集）三组样品分别为，健康对照组20例健康人血清、疾病对照组10例荨麻疹患者血清、银屑病患者组50例患者血清。
主要结果：
1. 疾病诊断生物标志物研究：同时采用DIA和定制化抗体芯片对筛选阶段3组样品进行检测，经统计分析，发现58个差异蛋白（P <0.01）可显著区分银屑病患者和健康对照，基于这些差异蛋白进行主成分分析，也同样可区分两组，其中一个蛋白PFN1在DIA和抗体两种技术的定量结果中，均在银屑病患者和健康对照组中有显著差异。在发现集和独立验证集中，用ELISA技术对PI3进行验证，结果均表明其在银屑病患者组中高表达。说明其找到的差异蛋白可能成为银屑病的潜在标志物。
图3 银屑病诊断标志物结果
A）基于差异蛋白质的无监督聚类分析对健康和银屑病患者进行分类；（B）基于差异表达蛋白质的主成分分析对健康和银屑病患者进行分类；（C）使用DIA-MS和抗体微阵列对PFN1蛋白表达量进行交叉验证；（D）ELISA验证PI3作为银屑病患者生物标志物的效果
2. 中药疗效生物标志物研究：选择11名银屑病患者，口服药物治疗12周。结果显示6例有效，5例无效；为寻找疗效预测生物标志物，比较了药物治疗前应答者（n＝6）和无应答者（n＝5）的血清蛋白表达，找到12个差异表达的蛋白；药物治疗12周后，应答者血清中FCN2、MIF和MMP1的表达水平始终高于无应答者，表明其可用于预测药物治疗有效的分子标志物。
图4 银屑病中药疗效标志性检测结果
（A）银屑病患者对中药治疗的不同反应；（B）基于差异表达蛋白质的无监督聚类分析对应答者和非应答者进行分类；（C）治疗前和治疗后12周蛋白质表达水平的变化。
1、蛋白鉴定和定量概况
表1 各样本鉴定结果概览
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Name |
Peptide number |
Protein number |
|
N_1 |
73592 |
7123 |
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N_2 |
83437 |
7720 |
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…… |
…… |
…… |
表2 差异蛋白统计列表
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Comparsion group |
Down-regulated |
Non-regulated |
Up-regulated |
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T-VS-N |
381 |
8005 |
703 |
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XR-VS-N |
242 |
8369 |
479 |
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XR-VS-T |
137 |
9020 |
118 |
图1 差异蛋白统计图
以Fold change≥2和Q-Value＜0.05两个条件作为显著性差异蛋白的筛选标准，得到组间上下调蛋白统计（左图）及火山图（右图）
2、质控
图2 CV分布及主成分分析
根据组内变异系数（CV，左图）评估实验的稳定性和重复性；通过主成分分析（PCA，右图），将同一实验组不同样本间聚合成簇。
3、功能分析
图3 多样本关联分析结果展示
左图，样本相关性分析热图；右图，时间序列分析
图4 显著富集的pathway统计图
图中x轴富集因子为注释到该Pathway的差异蛋白数除以注释到该Pathway的所有鉴定到的蛋白
图5 差异蛋白互作关系网络图
图6 差异蛋白亚细胞定位柱状图
4、蛋白质组与转录组/RNA-seq表达量关联分析
对转录组与蛋白组中每个比对组所有关联上的mRNA和蛋白质的表达量相关性进行分析，如下图，展示了差异显著的mRNA和蛋白表达量一致的基因：
图7 横坐标为蛋白质的表达量，纵坐标为基因的表达量
将两个组学的富集条目进行关联分析，得到两个组学层面上的富集情况，按照“Pathway通路富集关联数量统计”中描述的情况，统计各个Pathway通路在9种情形的分布情况。
图8 Pathway显著富集通路关联基因的分类分布
图9 网页版的形式展示
可用鼠标点击Pathway图中的各个基因，相应的蛋白和mRNA的表达量信息会出现在左上角
表达量关联分析的关键在于分析基因表达产物上下游的调控关系，通过整合转录组与蛋白组在同一条代谢通路上的表达量情况，可以很直观地展示基因的调控作用。
转录因子在动植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的调控作用。在两个组学水平上分别进行转录因子注释，可比较不同组学层面的转录因子差异，并对转录因子超家族进行归类和比较，以期从中筛选出重要的转录因子做进一步分析。
图10 两个组学关联数目排名前10的转录因子超家族
横轴为转录因子超家族，纵轴为数量。
表1 组织类样品送样要求
| 样品类型 | 送样量 | 备注 |
| 新鲜动物组织干重 | ≥5mg | 富含杂质或蛋白质含量低的样品量干重≥5g，如植物的根、木质部、韧皮部组织等 |
| 植物和蕈类真菌（如蘑菇、木耳）类 样品量湿重 |
≥300mg | |
| 酵母、霉菌类真菌和细菌、噬菌体等微生物 | ≥50mg，或细胞数≥5×106 | |
| 新鲜培养细胞数(个) | ≥1×107（细胞沉淀体积约30μl~50μl左右） | |
| 客户分离好的外泌体 | ≥20μg，浓度≥0.5μg/µL | |
| 血液类（去高丰度） | 血清、血浆≥200µl | 解冻后血细胞会破裂，蛋白溶出来会影响分析，因此一般不建议送全血 |
表2 蛋白类样品送样要求
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样本类型 |
送样量 |
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蛋白液 |
≥100μg，浓度≥0.5µg/µL |
Q1：怎样选择标记定量或非标记定量？
标记定量一般用于比较背景相似的样本间的蛋白组差异，若同组比较的样本数≤8，推荐选择iTRAQ标记技术；若同组比较的样本数＞8且≤10，推荐选择IBT标记技术。非标记定量技术的限制情况相对较少，无论样本间背景是否相似，若同组比较样本数＞10，都可推荐选择非标记蛋白定量DIA；若希望蛋白鉴定数越多越好，或需要鉴定单个样本中的特有蛋白，样本数＜10，也可推荐使用DIA。
综上，以下情况可优先选择iTRAQ：
1、定量样本数低于8个（即同时比较的样本数≤8）
2、样本背景极为相似（相同物种和相同的样本类型）
3、经费有限，需要通过高性价比方案完成研究
4、实现更好的重复样本间的定量重复性
更适合选择蛋白DIA定量分析的情况：
1、实验样本数高于10组
2、不同物种、不同来源或部位的样本，需要同时进行蛋白组分析和定量
4、追求更精准的定性定量效果，避免标记和液相分组引入的实验误差
5、需要对采集的数据进行多次分析
介于9-10个样本的项目，推荐华大IBT 10-plex定量产品。
Q2：蛋白定量DIA和传统的非标记定量有何优势？
传统的非标记定量一般需要通过分级的方法开展，耗时久、重复性差、数据结果可信度不高；蛋白定量DIA技术是新一代非标记定量技术，可通过更优的数据采集模式，在相同时间采集到更丰富的信息，压缩周期的同时，大福度提高样本间平行比较的重复性，数据结果可信度极高。
