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蛋白 DIA 定量分析
蛋白定量DIA产品，主要采用数据非依赖性采集模式（data independent acquisition，DIA），通过液质联用技术（LC-MS/MS）对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，结合传统的数据依赖性采集模式（data dependent acquisition，DDA）构建的谱图库，利用业内顶尖的商业化DIA分析软件Spectronaut，可对蛋白质组进行鉴定、定量，获得肽段、蛋白及所属物种来源、蛋白表达量变化等信息。
产品优势
蛋白定量DIA技术，采用全景式数据采集模式，效果对比下：
图1 HRM（DIA）vs Shotgun proteomics（DDA）
图中横坐标是分组的样本编号，纵坐标是蛋白质种类，该图展示的是各样本中，不同质谱采集模式下，蛋白质峰强度情况。其中DIA比DDA的峰强度覆盖度更好，偏向性较小；DDA缺失值较多，并且对高丰度肽段有偏向性。
- 鉴定数高：鉴定数提高30%；一针组织样本鉴定数可达7000+
- 重复性好：技术重复性提高30%，可达90%
- 定量准确性好：通过二级谱峰面积定量，大项目质控CV低至25%
- 质控完善：加入iRT校正；QC样本重复性CV<30%的比例大于67％
- 周期短：实际样本上机不分组，提高结果重复性的同时，压缩周期3倍以上
- 费用低：降低费用3倍以上
产品应用
技术路线
信息分析内容
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信息分析条款 |
信息分析内容 |
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标准信息分析 |
1 谱图库构建 1.1 数据产出统计 1.2 谱图库鉴定结果 2 标准信息分析内容 2.1 数据产出统计 2.2 数据质控（组内变异系数、主成分分析以及样本定量相关性） 2.3 蛋白质鉴定和定量结果 2.4 蛋白质GO分析 2.5 蛋白质COG/KOG分析 2.6 蛋白质Pathway代谢通路分析 2.7 差异蛋白的GO富集分析 2.8 差异蛋白COG/KOG富集分析 2.9 差异蛋白的Pathway富集分析 2.10 重复性分析（仅针对设计了重复的实验） 2.11多样品间表达模式聚类（三个或三个以上样品可提供） 2.12 时间序列分析 2.13 差异表达蛋白互作分析 2.14 差异表达蛋白亚细胞定位 |
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定制化信息分析 |
3 蛋白质组与转录组/RNA-seq表达量关联分析 3.1 表达量关联分析： 3.1.1 从鉴定、定量、差异三个层面进行关联统计 3.1.2 对定量层面关联结果细分为如下五类，并分别对其做GO/COG/Pathway注释分析： 蛋白和mRNA表达趋势相反； 蛋白无变化，mRNA差异表达； mRNA无变化，蛋白差异表达； 蛋白和mRNA均无变化。 3.1.3 蛋白组与转录组聚类分析 3.2 功能富集关联分析 3.2.1 GO富集关联分析 3.2.2 Pathway富集关联分析 3.3 转录组和蛋白组的Pathway整合图 |
1、11家实验室SWATH*技术平行性评测
Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature communications. 2017.
*注：SWATH技术与DIA技术原理相同，同为二级谱采集荷质比范围内全部母离子的碎片离子信息，但不同仪器公司开发此技术时使用的名称有别，故可以理解为同一种技术。
背景：实验结果可重复是科学研究最基础的原则。本文评估了全球11家实验室共同鉴定和定量到的蛋白数据集，其重现性、线性动态范围和灵敏度都非常接近于SRM——蛋白定量金标准。这份数据支持SWATH联合肽段标准打分的分析方法，适合于大范围实验室间全面、重现性好的蛋白组研究。
方法思路：
图1 实验设计
30个稳定同位素标记肽段（SIS）分成5组（group A-E），每组6种肽段，每组样本中肽段的稀释浓度从1fmol到10pmol（绿色标记S5），然后将每组肽段稀释4次后混入HEK293样本中（S1-4），获得一系列稀释浓度从0.012到10000fmol。将样本分成相同的11份分发给全球范围内的11个实验室，评估1天、1周内不同地点的数据采集情况。
主要结论：
1）蛋白鉴定情况
在全球11个实验室采集的229份SWATH-MS数据中，过滤条件为蛋白水平FDR 1%，共检测到4984种蛋白，4077种蛋白在超过80%的样本中被检测到。
图2 蛋白鉴定的数目和一致性
每种颜色代表一个实验室的所有数据，11个实验室所有数据集的重复性中位数是91.6%（蛋白水平）和79.5%（肽段水平）
2）定量重现性
经过肽段水平的中位数均一化后，利用4077种在超过80%样本中检测到的蛋白去计算同一天内、不同天内、不同实验室数据采集之间的变异系数，分别是8.3 ± 16.2%, 11.9 ± 17.2%, and 22.0 ± 17.4%。
图3 变异系数
比较单个实验室一天内、不同天内的CV变化，以及不同实验室间的CV变化
3）线性和动态范围
利用样本中加入的同位素标准肽段，在每个实验室计算梯度浓度设置的标准肽定量结果线性拟合系数，平均决定系数（R2）是0.97。去除高浓度肽段信号饱和的点，决定系数增加到0.99。在样本之间设置的标准肽理论倍数有9和27，实际检测到的差异倍数是7.49和19.6，主要原因也是高浓度的标准肽已经导致质谱仪信号检测饱和。
图4 平均峰面积和蛋白水平动态范围统计
平均峰面积图各点连接显示出各实验室间良好的线性指标（图左），蛋白水平动态范围是4.5个数量级范围（图右）
展望：
- 目前SWATH-MS蛋白定量技术没有选择最优肽段定量蛋白，是未来优化技术的一个方向。
- 本研究证明了SWATH-MS适用大规模样本蛋白组学水平的定量，为后续的药物靶点研究、精准医疗提供了必要工具。
- 大规模样本量的蛋白组学定量，可以与基因组学水平的关联分析，比如基于蛋白表达水平的数量遗传性状研究、基于蛋白表达水平的全基因组关联分析和药物筛选。
2、蛋白定量DIA用于慢性疼痛的研究
Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of Mouse Dorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain. Molecular & Cellular Proteomics. 2016.
背景：慢性疼痛是一种治疗方案有限的复杂疾病。虽对其发病机理进行了多次研究，但各结果间存在较大不一致性，主要受限于传统蛋白质组shotgun技术固有的缺陷。发病机制依然不清晰。
实验设计：
- 炎症性疼痛和神经性疼痛两种模型鼠及其对应control鼠共4组，各3个生物学重复
- 每个生物学重复由10-13只鼠pooling而成
- 解剖获得同侧背根神经节膜部分提取蛋白进行DIA蛋白定量
图 5 实验设计类型
CFA慢性炎症性疼痛模型、Veh为其对照；SNI慢性神经性疼痛模型、Sham为其对照
主要发现：
1）DDA建库鉴定到3067个蛋白，迄今鉴定数最多的背根神经节蛋白研究。
2）DIA四组都鉴定到的蛋白有2526个，其中CFA和Vehicle都鉴定到的有2581个；SNI和Sham都鉴定到的2600个，表明实验重复性较好。
3）炎症性和神经性疼痛差异蛋白分别为64和77，两种模式共有差异蛋白为12个。
4）其中Serca蛋白在两种模式小鼠中表达量变化相反，表明两种疼痛的调控机制不同。
5）western blot和免疫组化对上述DIA结果进行了验证。
图6 四组实验模型的蛋白聚类分析
1、蛋白鉴定和定量概况
表1 各样本鉴定结果概览
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Name |
Peptide number |
Protein number |
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N_1 |
73592 |
7123 |
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N_2 |
83437 |
7720 |
|
…… |
…… |
…… |
表2 差异蛋白统计列表
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Comparsion group |
Down-regulated |
Non-regulated |
Up-regulated |
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T-VS-N |
381 |
8005 |
703 |
|
XR-VS-N |
242 |
8369 |
479 |
|
XR-VS-T |
137 |
9020 |
118 |
图1 差异蛋白统计图
以Fold change≥2和Q-Value＜0.05两个条件作为显著性差异蛋白的筛选标准，得到组间上下调蛋白统计（左图）及火山图（右图）
2、质控
图2 CV分布及主成分分析
根据组内变异系数（CV，左图）评估实验的稳定性和重复性；通过主成分分析（PCA，右图），将同一实验组不同样本间聚合成簇。
3、功能分析
图3 多样本关联分析结果展示
左图，样本相关性分析热图；右图，时间序列分析
图4 显著富集的pathway统计图
图中x轴富集因子为注释到该Pathway的差异蛋白数除以注释到该Pathway的所有鉴定到的蛋白
表1 组织类样品送样要求
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样品类型 |
送样量 |
备注 |
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新鲜动物组织干重 |
≥50mg |
富含杂质或蛋白质含量低的样品量干重≥5g，如植物的根、木质部、韧皮部组织等 |
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植物和蕈类真菌（如蘑菇、木耳）类 样品量湿重 |
≥1g |
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酵母、霉菌类真菌和细菌、噬菌体等微生物 |
200mg |
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新鲜培养细胞数(个) |
≥3~5×106（细胞沉淀体积 约30ul~50µl左右） |
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血液类 |
血清、血浆≥500µl；全血 ≥5ml |
解冻后血细胞会破裂，蛋白溶出来会影响分析，因此一般不建议送全血 |
表2 蛋白类样品送样要求
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样本类型 |
送样量 |
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蛋白液 |
≥200μg，浓度≥1µg/µl |
Q1：怎样选择标记定量或非标记定量？
标记定量一般用于比较背景相似的样本间的蛋白组差异，若同组比较的样本数≤8，推荐选择iTRAQ标记技术；若同组比较的样本数＞8且≤10，推荐选择IBT标记技术。非标记定量技术的限制情况相对较少，无论样本间背景是否相似，若同组比较样本数＞10，都可推荐选择非标记蛋白定量DIA；若希望蛋白鉴定数越多越好，或需要鉴定单个样本中的特有蛋白，样本数＜10，也可推荐使用DIA。
综上，以下情况可优先选择iTRAQ：
1、定量样本数低于8个（即同时比较的样本数≤8）
2、样本背景极为相似（相同物种和相同的样本类型）
3、经费有限，需要通过高性价比方案完成研究
4、实现更好的重复样本间的定量重复性
更适合选择蛋白DIA定量分析的情况：
1、实验样本数高于10组
2、不同物种、不同来源或部位的样本，需要同时进行蛋白组分析和定量
4、追求更精准的定性定量效果，避免标记和液相分组引入的实验误差
5、需要对采集的数据进行多次分析
介于9-10个样本的项目，推荐华大IBT 10-plex定量产品。
Q2：蛋白定量DIA和传统的非标记定量有何优势？
传统的非标记定量一般需要通过分级的方法开展，耗时久、重复性差、数据结果可信度不高；蛋白定量DIA技术是新一代非标记定量技术，可通过更优的数据采集模式，在相同时间采集到更丰富的信息，压缩周期的同时，大福度提高样本间平行比较的重复性，数据结果可信度极高。