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产品服务

Sequencing services

RNA-Seq

        RNA-Seq,对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序,可以提供定量分析,检测基因表达水平差异。


技术优势

数字化信号:测序直接获得序列,无背景噪音,无交叉杂交;可鉴别序列间单个碱基的差异;

高通量:一次测序得到千万条以上的序列;

检测阈值宽:跨越6个数量级的宽检测阈值,从几个到数十万个拷贝精确计数;

良好的重复性:深度测序保证了抽样随机性,重复性非常好,无需重复实验;

高灵活性 :依据客户需求,提供不同测序平台服务。

 

产品应用

医学上的应用方向——

 

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农学上的应用方向 ——

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研究内容

标准信息分析:

1)测序数据过滤;

2)参考基因组比对;

3)基因表达量分析;

4)基因表达量聚类分析;

5)时间序列分析(3个或3组及以上样品);

6)差异表达基因检测;

7)差异表达基因维恩分析;

8)差异表达基因层次聚类分析;

9)差异表达基因GO功能分析和网络图;

10)差异表达基因Pathway功能分析和网络图;

11)差异表达基因转录因子编码能力预测和网络图(植物、动物样品);

12)差异表达基因蛋白互作分析;

13)差异表达基因中的真菌致病基因预测(真菌样品);

14)差异表达基因中的植物抗病基因预测(植物样品)

高级信息分析:

1)基因共表达网络分析(15个及以上样品,不包含在标准执行周期内)

定制化信息分析:

1. 可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析内容。


医学案例:BGISEQ-500 RNA-Seq抗乙肝病毒免疫机制研究

案例描述:

        全球有乙肝病毒(HBV)感染而导致的乙肝患者超过3.5亿,其中约1/3在中国。除了接种疫苗,目前广泛使用抗病毒天然免疫细胞因子IFNα(I型干扰素)治疗,但效率低,其分子机制尚不清楚。

       本研究通过高通量小RNA干扰筛选、特异性敲除基因的小鼠模型、BGISEQ-500 RNA-Seq等技术手段,揭示了甲基转移酶SETD2分子直接催化信号蛋白STAT1甲基化修饰在IFN的抗病毒免疫中起关键作用的新机制,为病毒感染性疾病的治疗提供了新靶点。

研究结果:

1、SETD2经SET域促进STAT1活化,从而提高干扰素诱导的抗病毒功能:

       HepG2细胞中敲除SETD2,产生出3个SETD2-KO细胞系,呈现出SETD2表达缺失和总的H3K36me3水平下降(图F),与对照HepG2相比,都表现出干扰素诱导的STAT1磷酸化作用受损(图G)。观察干扰素处理的SETD2-KO HepG2细胞,IFNAR1/R2或 STAT1上游信号分子的表达没有显著差异。通过RNA-Seq分析,发现一系列ISGs响应干扰素刺激,在SETD2-KO细胞比HepG2 WT细胞表达更低(图H)。qRT-PCR分析确定干扰素刺激后在SETD2-KO细胞中两个ISG表达降低,包括ISG15 和MX2(图I)。所以,在干扰素刺激下,SETD2提高STAT1磷酸化作用和ISG表达。

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图1 SETD2促进干扰素诱导的STAT1 磷酸化和 ISGs 表达

2、SETD2选择性促进H3K36me3修饰的ISGs表达

       利用RNA-Seq,在SETD2-KO细胞、STAT1-K525A-Re细胞、STAT1-KO细胞以及对照的HepG2 细胞在干扰素刺激下6小时(图2A)。干扰素刺激后对照HepG2细胞中222个基因被诱导,SETD2-KO 细胞、STAT1-K525A-Re细胞和STAT1-KO 细胞,与对照HepG2细胞相比,分别有89、128和180个基因显著性下调(图2B)。GO富集分析显示SETD2-KO 细胞和 STAT1-K525A-Re细胞中表达更低的基因被归类于病毒的防御反应或I型干扰素通路相关基因(图2C)。STAT1-KO细胞在干扰素刺激下下调的180个基因,其中有40%的基因在SETD2-KO细胞在干扰素刺激下也表达更低,包括SETD2促进一系列的STAT1依赖的ISG(图2D)。另外,在干扰素刺激后的SETD2-KO 细胞和STAT1-K525A-Re细胞中,75个基因表达更低,包括有抗病毒功能的ISGs,比如ISG15、ISG20、MX2等(图2D和2E)。进一步确定了SETD2介导的ISGs调控是在很大程度上依赖于在介导STAT1 K525单甲基化作用中它起到的作用。

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图2 SETD2选择性催化一些ISGs的 H3K36me3 修饰

参考文献

Chen K, Liu J, Liu S, et al. Methyltransferase SETD2-Mediated Methylation of STAT1 Is Critical for Interferon Antiviral Activity. Cell. 2017 Jul 27;170(3):492-506.e14.

 

农学案例:BGISEQ-500 RNA-Seq拟南芥防御反应研究

       铜离子是所有生物体所必需的,研究者之前报道过拟南芥中铜离子能引起防御反应,这依赖于乙烯信号通路。但是铜离子引起乙烯生物合成的机制仍不清楚。本研究借助BGISEQ-500 RNA-Seq对6个拟南芥样本,即铜离子处理3个不同时间点,2组生物学重复进行测序,发现铜离子特异性激活拟南芥AtACS8基因表达,来促进乙烯早期生物合成,进而引起拟南芥防御反应。而且,铜离子诱导的AtACS8表达,是依赖于AtACS8启动子区的铜响应顺式元件(CuRE)。

结果展示:

1、拟南芥CuSO4处理后基因表达差异

       2周大野生型拟南芥植株样品,CuSO4处理后0、2、24h,2个生物学重复,共6个样品BGISEQ-500 RNA-Seq,SE50,24M clean reads,Clean Data Rate高达99.95%。说明BGISEQ-500 RNA-Seq测序数据质量很高。

        CuSO4处理后,2小时后2206个上调,1009个下调基因,24小时后2423个上调,590个下调基因(图1A)。快速(2小时)上调基因中,370个基因是被鞭毛蛋白和延伸因子上调(图1B)。qRT-PCR验证上调基因,发现所有挑选基因验证结果与测序相似(图1C)。GO分析发现79.30%的上调基因可以归类于代谢进程,细胞进程和刺激响应。技术验证测序结果说明BGISEQ-500 RNA-Seq定量准确性很高。

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图3 铜离子调控下拟南芥基因表达情况

2、铜离子激活拟南芥乙烯生物合成通路

       通过测序获得CuSO4处理2小时后快速地受诱导的基因中,有一些是参与乙烯生物合成的(图2A),这其中包含了AtACS8等基因。qRT-PCR验证获得的这些乙烯合成基因,发现所有挑选的基因的验证结果与测序相似(图2B)。这些结果说明铜离子诱导了拟南芥乙烯合成基因的表达。技术验证测序结果说明BGISEQ-500 RNA-Seq定量准确性很高。

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图4 CuSO4处理后乙烯生物合成通路基因的表达情况

参考文献

Zhang B, Liu H, Ding X, et al. AtACS8 plays a critical role in the early biosynthesis of ethylene elicited by copper ions in Arabidopsis. Journal of Cell Science.2017 Aug 3. pii: jcs.202424.


                                               图3第一个图HBRR-VS-UHRR图3第二个图HBRR2-VS-UHRR2_PossionDis_Method_network

      图3第三图 第二排第一个HBRR2-VS-UHRR2图3第四个图 第二排第二个HBRR1-VS-UHRR1图3第五个图 第二排第三个Coexpression

图1 GO、KEGG、蛋白互作网络、转录因子和WGCNA的基因共表达等五大特色关系网络图

                            图4 第一个图 第一排左图4 第二个图 第一排右blue

                           图4 第三个图 第二排左Modules_gene_black图4 最后一个图 第二排右

图2 共表达基因模块与样品的相关性总览图,单个模块的基因共表达网络图、GO和KEGG功能注释


表1 BGISEQ-500 RNA-Seq样品判定标准

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Q1:RNA-Seq是否需要做生物学重复?如果需要,一般要多少个重复样本?

是的,2011 年 7 月 Hansen[1]发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性,与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。生物学重复实验,可以在很大程度上消除样本的个体差异、系统平台差异,能更准确地检测差异基因。如果不设生物学重复,高影响因子的杂志可能会遭编辑质疑。不建议2个生物学重复是因为,如果两者结果不一致,无法确定以哪个数据为参考。3个生物学重复,如果出现1个结果不一致的,可以取另外2个的结果。

Q2:RNA-Seq必须要有参考基因组序列吗?

不是必须要有参考基因组序列,但一定要有参考序列,如unigene序列、mRNA序列、CDS序列等可以作为参考序列。也可通过参考有基因组序列的近缘物种的基因注释信息来完成相应的标准信息分析,不过此种方法并不推荐。

Q3:RNA-Seq如果没有参考序列怎么解决?

推荐做转录组de novo组装获得unigene作为RNA-Seq参考序列。需要注意的是,要把所有做RNA-Seq的样品,都混合成一个样品,做转录组。

Q4:RNA-Seq推荐测序数据量与基因组大小有关吗?

RNA-Seq推荐的测序数据量,主要与基因数量有关,不同物种基因组大小相差比较大,但是编码基因的数量相差并不大,一般物种在3万左右。所以对于一般物种的RNA-Seq数据量,10M clean reads是足够的。一般HiSeq平台推荐10M clean reads数据量,BGISEQ-500平台,为了给研究者更准确全面的数据结果,提供20M clean reads,而价格比HiSeq平台10M clean reads数据量还低。

Q5:有些观点认为RNA-Seq测序策略是SE100,有必要测这么长吗? PE测序是不是会比SE测序更好?

没有必要,SE50足够。做RNA-Seq,只要将得到的reads比对到参考基因集,得到基因ID就可以了,不需要那么长,因为不需要做组装,也不需要做定性分析。文献支持:康奈尔大学维尔医学院的研究人员在Genome Biology杂志上发表文章[2]认为对于差异表达分析而言,读长并非越长越好。研究人员认为,在RNA-seq研究中使用什么样的读长,这要取决于研究的最终目的。如果只需要差异表达基因,那么50 bp的单端读取就够了。与100 bp的双端读取相比,使用50 bp的单端读取能够节省成本、时间。

Q6:测序后有何验证方法?

实验验证的方法最常见的是通过实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)技术来验证测序结果。还有FISH(原位荧光杂交)、微阵列芯片技术、Northern blot等。 功能验证一般是基因敲除、敲低或过表达,转基因等。

Q7:BGISEQ-500 RNA-Seq有没有发布demo数据?

已发布一个UHRR人标准品下机数据并共享了数据结果和分析方法。网址:http://www.bgitechsolutions.com/science/cat-91-588-1464.html。


参考文献

1. Kasper D Hansen, Zhijin Wu, et al. Sequencing technology does not eliminate biological variability. Nature Biotechnology. 2011. 29(7): 572–573.

2. Chhangawala S, Rudy G, Mason CE, et al. The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection. Genome Biology. 2015 Jun 23;16:131.


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