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真核转录组测序

       转录组测序,对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序,既可以提供定量分析,检测基因表达水平差异,又可以提供结构分析,能发现未知转录本和稀有转录本,精确地识别可变剪切位点、基因融合、SNP以及Indel位点等,而且不依赖于参考基因组。


技术优势

任意物种的全转录组分析:无需预先设计特异性探针,因此无需了解物种基因或基因组信息,能够直接对任何物种进行最全面的转录组分析;

覆盖度高:数字化信号,直接测定几乎所有转录本片段的序列;

检测阈值宽:跨越6个数量级的宽检测阈值,从几个到数十万个拷贝精确计数;

分辨率高:可以检测基因家族中相似基因及可变剪接造成的单碱基差异;

检测范围广:从几个到数十万个拷贝精确计数,可同时鉴定及定量正常和稀有的转录本。

产品应用

医学上的应用方向——

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农学上的应用方向 ——

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研究内容

一、无参考序列物种

标准信息分析:

 1. 测序数据过滤

2. 转录组de novo组装

3. Unigene七大功能数据库注释

4. Unigene的CDS预测

5. Unigene的TF编码能力预测

6. Unigene的SSR检测

7. Unigene表达量计算(基因表达水平、PCA分析、基因表达水平箱线图和密度图、样品间的表达量韦恩图)

8. 时间序列分析

9. 差异表达基因检测

10. 差异表达基因聚类分析

11. 差异表达基因GO功能分析

12. 差异表达基因Pathway功能分析

13. 差异基因蛋白互作分析

14. 真菌致病基因预测 (真菌样本)

15. 植物抗病基因预测(植物样本)

定制化信息分析:

1. 可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析内容。

 

二、有参考序列物种

标准信息分析:

1. 测序数据过滤

2. 参考基因组比对

3. 新转录本预测

4. SNP和INDEL检测

5. 融合基因检测(仅适用于人的癌症融合基因研究,每个样本8G以上数据量)

6. 差异剪接基因检测

7. 基因表达量计算(基因比对率及表达数目统计、Reads对转录本的覆盖度及分布、样品间的相关性、PCA分析、样品中基因表达量的分布、样品间及组间的基因表达情况)

8. SNP、INDEL、基因表达量和基因融合Circos图(仅限人的样本)

9. 基因表达量聚类分析

10. 时间序列分析

11. 差异表达基因检测

12. 差异表达基因维恩图分析

13. 差异表达基因层次聚类分析

14. 差异表达基因GO功能分析

15. 差异表达基因Pathway功能分析

16. 差异表达基因TF编码能力预测

17. 差异表达基因蛋白互作分析

18. 差异表达基因中的真菌致病基因预测(真菌样本)

19. 差异表达基因中的植物抗病基因预测(植物样本)

高级信息分析:

1. 基因共表达网络分析(15个及以上样品,不包含在标准执行周期内)

定制化信息分析 :

1. 可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析内容


医学案例:转录组研究恶性肿瘤诱导分化

研究目的:研究恶性肿瘤诱导分化治疗。

研究材料:人恶性胶质母细胞瘤细胞经化合物诱导0h, 6h, 12h, 24h和48h。

研究方法:转录组测序,每个样本2.3-2.4Gb。

研究背景

         沃伯格效应(Warburg Effect)是恶性肿瘤的特征之一,是恶性肿瘤赖以生存的代谢模式。具体来说,绝大部分正常细胞在有氧的情况下以氧化代谢为主,而肿瘤细胞即使在氧供充足的情况下也会将葡萄糖优先进行糖酵解,为自身合成生物大分子提供必需的原料。

        恶性胶质母细胞瘤(GBM)占大脑恶性肿瘤的60%,即使接受手术、放疗和化疗的综合疗法,病人的中位生存期也不超过1年。

研究结果:

        1、在缺乏可靠治疗手段的恶性胶质母细胞瘤上,本研究发现,逆转这些细胞的沃伯格代谢模式,即将细胞从糖酵解为主转变为氧化代谢为主(反沃伯格效应),可以使恶性细胞转变为正常的星型胶质细胞。他们通过转录组和蛋白质组学数据分析发现,化合物诱导的胶质细胞与诱导前的恶性细胞相比较,差异显著基因集中于线粒体生成和氧化磷酸化相关通路。

         2、进一步的实验证实,化合物诱导恶性细胞出现代谢重编程,此效应由cAMP-PGC1α通路激活介导。PGC1α促进肿瘤细胞的线粒体生物合成增加,进而引起反沃伯格效应,即增强细胞氧化代谢和降低糖酵解。反沃伯格效应使肿瘤细胞的营养物质更多被氧化代谢所消耗,引起生物大分子合成缺乏原料,最终驱动肿瘤细胞的命运走向分化。

        3、此研究工作的重要意义在于,证实逆转沃伯格效应可驱动恶性胶质母细胞瘤细胞向正常细胞方向分化,为恶性肿瘤诱导分化疗法提供了新的策略。

                        图片3

图1  转录组和蛋白质组学数据发现化合物诱导的胶质细胞氧化代谢增

参考文献:

 Xing F, Luan Y, Cai J, et al. The Anti-Warburg Effect Elicited by the cAMPPGC1α Pathway Drives Differentiation of Glioblastoma Cells into Astrocytes. Cell Reports. 2017 Jan 10;18(2):468-481.


农学案例:转录组测序构建大鲵的参考基因集

研究目的:构建大鲵完整的参考基因集。

研究材料:收集成年中国大鲵的20多个组织样本(腹部皮肤、背部皮肤、侧部皮肤、肺、心脏、肾、胰腺、小肠、脾脏、胃、脑、脊髓、软骨、眼睛、指尖、长骨、上颌骨、头盖骨、肌肉、 卵巢、脂肪、尾部脂肪、血液)。

研究方法:转录组测序,每个样本约为6.5Gb。

研究结果

1. 为了获得一个完整的参考基因集,将所有样本的clean reads混合在一起组装得到93,366条非冗余转录本,平均长度1,326bp。

2. 将组装得到的序列注释到NR、Swiss-Prot,KEGG、COG、GO数据库进行功能注释,最后有41,874条序列被注释到。

3. 采用BlastX,ESTscan、Transdecoder 软件分别预测CDS序列,然后再进行整合(至少2种方法支持),并且需要CPC≥1,最后鉴定了26,135个蛋白。

                                                      图片16

图2 转录组组装评估

B: BUSCO评估基因集、C和D:和热带爪蟾、高山倭蛙比较CDS长度

参考文献:

Geng X, Li W, Shang H, Gou Q, et al. A reference gene set construction using RNA-seq of multiple tissues of Chinese Giant Salamander, Andrias davidianus. Gigascience. 2017 Feb 15. doi: 10.1093/gigascience/gix006.

转录组测序信息分析2018升级版

部分升级内容展示:

 

                                             图1 busco_figure (2)

图1   单拷贝直向同源数据库BUSCO评价组装质量

 

                                    图2 左 SNP SnpSummary[1]图2 右 Splice AsSummary[1]

图2  SNP类型、差异可变剪接数目堆积图

 

                                                            图3第一个图HBRR-VS-UHRR图3第二个图HBRR2-VS-UHRR2_PossionDis_Method_network

 

                                图3第三图 第二排第一个HBRR2-VS-UHRR2图3第四个图 第二排第二个HBRR1-VS-UHRR1图3第五个图 第二排第三个Coexpression

图3 GO、KEGG、蛋白互作网络、转录因子和WGCNA的基因共表达等五大特色关系网络图

                           图4 第一个图 第一排左图4 第二个图 第一排右blue

                                 图4 第三个图 第二排左Modules_gene_black图4 最后一个图 第二排右

图4  共表达基因模块与样品的相关性总览图,单个模块的基因共表达网络图、GO和KEGG功能注释


表1 真核转录组测序样品判定标准

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Q1:BGISEQ-500滚环扩增技术的特点是什么?

滚环扩增技术RCA的模板始终是同段序列,扩增错误不会累积,与PCR指数扩增相比于保真优势。

Q2:BGISEQ-500平台的测序原理是什么?

BGISEQ-500采用优化的联合探针锚定聚合技术(cPAS)和改进的DNA纳米球(DNB)核心测序技术,是行业领先的高通量测序平台之一。具体而言,首先DNA分子锚和荧光探针在纳米球上进行聚合,随后高分辨率成像系统对光信号进行采集,光信号经过数字化处理后即可获得待测序列。其中,DNB通过线性扩增增强信号,降低单拷贝的错误率。而且,DNB大小与芯片上活性位点的大小相匹配,每个位点结合一个DNA纳米球,在保证测序精度的情况下提高了测序芯片的利用效率。

Q3:BGISEQ-500 下机数据格式是什么?

通用下机数据格式:(FASTQ)让数据兼容性更好。

Q4:BGISEQ-500平台真核转录组推荐数据量?

推荐6G或者10G数据量;

Q5: 可否提供BGISEQ-500转录组标准品测试数据供客户测评?

可以,我们 1个UHRR标准品,构建了3个文库,数据都已经上传到EBI。请点击下面链接下载。http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB19428。

Q6: 可否提供BGISEQ-500真核转录组实验流程英文版?

The first step in the workflow involves purifying the poly-A containing mRNA molecules using poly-T oligo-attached magnetic beads. Following purification, the mRNA is fragmented into small pieces using divalent cations under elevated temperature. The cleaved RNA fragments are copied into first strand cDNA using reverse transcriptase and random primers. This is followed by second strand cDNA synthesis using DNA Polymerase I and RNase H. These cDNA fragments then have the addition of a single 'A' base and subsequent ligation of the adapter. The products are then purified and enriched with PCR amplification.

We then quantified the PCR yield by Qubit and pooled samples together to make a single strand DNA circle (ssDNA circle), which gave the final library.

DNA nanoballs (DNBs) were generated with the ssDNA circle by rolling circle replication (RCR) to enlarge the fluorescent signals at the sequencing process. The DNBs were loaded into the patterned nanoarrays and pair-end read of 100 bp were read through on the BGISEQ-500 platform for the following data analysis study. For this step, the BGISEQ-500 platform combines the DNA nanoball-based nanoarrays and stepwise sequencing using Combinational Probe-Anchor Synthesis Sequencing Method.


 


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