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蛋白 iTRAQ /IBT 定量分析

       定量蛋白质组学(Quantitative Proteomics)是对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量。可用于筛选和寻找任何因素引起的样本之间的差异表达蛋白,结合生物信息学揭示细胞生理病理功能,同时也可对某些关键蛋白进行定性和定量分析。 

       iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术是由AB SCIEX公司研发的一种体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术。蛋白定量iTRAQ技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团,经高精度质谱仪串联分析,可同时比较多达8种样品之间的蛋白组表达量差异,是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。iTRAQ标签简图以及定量方法见下图:

图1


图1 iTRAQ试剂结构

iTRAQ试剂结构包括三个部分:报告基团、平衡基团、肽反应基团,其中同位素标签部分是指前两部分。

图2

图2 蛋白定量iTRAQ原理示意图

蛋白定量iTRAQ技术,样本酶解后的肽段进行iTRAQ标记后混合上机,通过二级质谱采集到报告基团的信号强度,判断不同样本间的蛋白丰富变化。

        IBT蛋白定量分析,作为常规iTRAQ蛋白定量分析的升级版,是华大基因首推的蛋白定量领域十标新产品。它基于华大基因与合作伙伴共同开发的IBT标记技术,通过深入优化实验步骤和信息分析流程,将原本iTRAQ技术的标记上限8个样本/批次,增加至10个样本/批次甚至更多,结合高分辨率质谱仪高效快速的扫描效率,全面解决多于8个比较组的蛋白样本定量问题。IBT蛋白定量分析产品能够提供优于常规iTRAQ技术的鉴定、定量结果,为广大客户提供一种性价比更高的蛋白组定量分析新选择。

图3

图3 IBT试剂结构

IBT(isobaric tags)试剂结构与iTRAQ类似:IBT由报告基团、平衡基团组成,分别有10标和6标两种试剂,可满足不用实验设计需求,其中小于7个样品的设计选取相差1Da的标签,大于7个样品选取相差0.006Da的标签。

 

表1 三种同重同位素标签报告基团汇总

Tag

iTRAQ

TMT

IBT

Mode

4-plex

8-plex

6-plex

10-plex

10plex (6-plex)

Reporter 1

114

113

126

126

114

Reporter 2

115

114

127

127N

115N

Reporter 3

116

115

128

127C

115C

Reporter 4

117

116

129

128N

116N

Reporter 5

 

117

130

128C

116C

Reporter 6

 

118

131

129N

117N

Reporter 7

 

119

 

129C

117C

Reporter 8

 

121

 

130N

118N

Reporter 9

 

 

 

130C

118C

Reporter 10

 

 

 

131

119

从功能上看,蛋白定量IBT类似于Thermo公司出品的同重同位素标签TMT,提供6-plex和10-plex两种标记试剂,供不同样本个数的项目选择合适的试剂。


产品优势

  • 高通量:可同时对10种以内实验样本进行蛋白组定量分析和比较。
  • 周期短:标记混合上样大幅度压缩机时, 缩短项目周期。
  • 高重复性:采用多个标记样本同时上机的方法,避免样本分别上机检测和传统制胶实验重复性差的问题。
  • 质控严格:MALDI结合LC-MS对酶解、标记步骤进行严格质控;IQuant软件对下机数据进行严格质控。
  • 一站式解决方案解决验证问题:蛋白定量iTRAQ/IBT结合MRM靶向蛋白定量方法, 提供从发现到验证一站式的解决方案,基于类似的液质联用平台开展实验,避免技术方法带来的结果差异。
  • 多组学方案联合深入挖掘数据:从基因组、转录组,到蛋白组、代谢组,完善的贯穿组学研究方法实现对数据结果的深入挖掘。

 

产品应用

人类疾病研究

  • 疾病生物标志物筛选和验证
  • 疾病发生发展过程中的蛋白表达调控机制
  • 药效评估

 动植物基础研究

  • 重要农作物农艺性及其改良措施
  • 动植物生长发育机制研究
  • 抗逆抗病机制研究

 

技术路线

  流程图

 

信息分析

信息分析条款

信息分析内容

标准信息分析

1 标准信息分析内容

1.1 数据产出统计

1.2 蛋白质鉴定结果

1.3 蛋白质定量结果

1.4 蛋白质GO分析

1.5 蛋白质COG/KOG分析

1.6 蛋白质Pathway代谢通路分析

1.7 差异蛋白的GO富集分析

1.8 差异蛋白的COG/KOG分析

1.9 差异蛋白的Pathway富集分析

1.10 重复性分析(仅针对设计了重复的实验)

1.11多样品间表达模式聚类(三个或三个以上样品可提供)

1.12 差异表达蛋白互作分析

1.13 差异表达蛋白亚细胞定位

定制化信息分析

变异与新转录本检测

2.1 在蛋白层面对SNP/SNV进行鉴定与定量

2.2 在蛋白层面对InDel进行鉴定与定量

2.3 在蛋白层面对可变剪切进行鉴定与定量(此项仅适用于转录本resequencing

2.4 在蛋白层面对新转录本进行鉴定与定量

适用的物种及数据库版本有限制,目前适用的物种有Hsapies ()Mmusculus(小鼠)Rnorvegicus(褐家鼠) ,其他物种及具体适用的数据库版本请咨询后台。

蛋白质组与转录组/RNA-seq表达量关联分析

3.1 表达量关联分析:

3.1.1 从鉴定、定量、差异三个层面进行关联统计

3.1.2 对定量层面关联结果细分为如下五类,并分别对其做GO/COG/Pathway注释分析

         蛋白和mRNA表达趋势相同;

         蛋白和mRNA表达趋势相反;

         蛋白无变化,mRNA差异表达;

         mRNA无变化,蛋白差异表达;

         蛋白和mRNA均无变化。

3.1.3 蛋白组与转录组聚类分析

3.2 功能富集关联分析

3.2.1 GO富集关联分析

3.2.2  Pathway富集关联分析

3.3 转录组和蛋白组的Pathway整合图


1、多组学技术研究结肠癌药物抗性与癌细胞非整倍体间的关系

Drug-resistance in Colorectal Cancer Cell Lines is Partially Associated with Aneuploidy Status in Light of Profiling Gene Expression. J. Proteome Res. 2016

背景:HCT116和LoVo是结直肠癌研究中常用的两种细胞系,其中HCT116是二倍体细胞,LoVo是多倍体细胞。SN38和QxPt是目前临床上治疗结直肠癌最常用的两种药物,但其抗药性经常影响临床效果,目前的研究对于抗药性的形成并没有解释。我们试图从基因表达水平,通过iTRAQ技术结合IBAQ分析,研究多倍体情况是否影响HCT116和LoVo两种细胞系的SN38或OxPt抗药性的形成。

 方法思路:

研究药物抗性,首先要了解药物诱导细胞内抗性反应的分子机制。很多癌细胞会产生非整倍体,需要确定是否非整倍体情况导致了药物抗性。外显子测序反映细胞的非整倍体状态,RNAseq和液质联用法检测mRNA和蛋白水平的基因表达情况。

  • 选择HCT116-SN38, HCT116-OxPt, LoVo-SN38,LoVo-OxPt为研究用细胞系;
  • 利用WES,mRNA,iTRAQ等技术进行基因表达水平及蛋白水平的染色体倍型分析。

 主要结论:

1)对HCT116, HCT116-OxPt, and HCT116-SN38而言,染色体倍型没有发生变化,说明染色体情况并没有影响HCT116细胞抗药性。

2)对LoVo, LoVo-OxPt, and LoVo-SN38, 多倍体在LoVo-SN38LoVof非抗药性细胞之间发生了变化,有一个三倍体出现在LoVo-SN38细胞中,这可能是SN-38抗药性形成的因素之一。

图1

图1 RNASeq和iTRAQ实验均证明两种细胞系单个染色体的基因表达情况与染色体状态一致

Lovo的5、7、12、15染色体表达高于HCT116。耐药菌株通过10个月不断提高药物浓度筛选出来。Lovo耐药株在SN38作用下,发生了14号染色体基因copy增加的情况;说明sn38影响了癌细胞的整倍体状态,与耐药性部分相关。

2、借助iTRAQ技术研究大豆胚根的蛋白功能

Combined transcriptomic and proteomic analysis constructs a new model for light-induced anthocyanin biosynthesis in eggplant (Solanum melongena L.). Plant Cell Environ. 2017.

背景:固有无序蛋白(IDPs)在所有生命体的重要生理过程中起到多种重要的作用,然而植物面临环境压力时和固有无序蛋白的表达量关系目前没有全面的报到。本文目的主要是通过对大豆胚根进行分析,研究压力相关蛋白,为了发现固有无序蛋白的功能,选择未萌发的胚根0mm和萌发出15mm长的胚根进行实验,综合分析抗压能力和蛋白功能。

实验设计:

  • 植物的处理:0mm、15mm大豆胚根;3次生物重复
  • 提取蛋白和iTRAQ标记:iTRAQ 8-plex
  • RT-PCR 和 Western-blotting
  • 圆二色性分析
  • LDH酶活测定
  • 固有无序蛋白的E-value

主要发现:

1)固有无序蛋白在生物体中发挥重要作用,iTRAQ定量的795个热稳定蛋白含有高比例的无序蛋白(15%),整体蛋白组的无序蛋白(9%)。热稳定蛋白包含IDPs可以在复苏过程中保护乳糖脱氢酶。

2)比较R0mm 和 R15mm 的大豆胚根中的795个热稳定蛋白,分别有170个和89个蛋白丰度改变,说明在种子生长过程中有很多蛋白发生了改变。

图2

图2 R0mm vs. R15mm火山图

从差异倍数和显著性筛选差异蛋白,图中标红的点即为符合条件的差异蛋白

 图3


图3 基因表达水平进行半定量RT-PCR和western blot

A 随机选取14个蛋白丰度R0mm提高的基因和3个丰度不变的进行RT-PCR ;B 挑选3个基因进行western blot。

3)KEGG分析表明,18个蛋白参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢,9个蛋白参与类苯基丙酮代谢通路。

4)各类研究结果综合表明,对压力细胞中酶和蛋白的保护是固有无序蛋白的生物功能。


1、  标准信息分析

1.1 蛋白鉴定结果

在某个蛋白质ITRAQ定量测试项目中,共有 8 组 Human 样品,分别为: A、B、C、D、E、F、G、H,共进行了2次重复实验,共有152673 张二级谱图生成下机。在"1%谱图水平FDR"过滤标准下,一共有26860 条肽段被鉴定到,而在"1%蛋白水平FDR"过滤标准下,一共有4065 个蛋白被鉴定到。下表展示各个样品的鉴定情况。

表1 各个样本蛋白的鉴定情况

表1

1.2 蛋白定量结果

 ITRAQ定量由华大开发软件IQuant来实现。在本项目中, B/AC/AC/BE/DF/DF/E 被设置为比较组。单次实验的显著差异蛋白以Fold change>=1.5 Q-value < 0.05 两个条件筛选。

 图1

图1 差异蛋白柱状图


图2

图2 差异蛋白火山图

1.3 蛋白GO、COG、Pathway注释分析,差异蛋白的GO、Pathway富集分析

GOCOGPathway注释分析及富集分析均是基于不同的系统,对检测到的蛋白或是有显著差异的蛋白进行划分。下图展示了差异蛋白显著富集的Pathway代谢通路,图中X轴富集因子(RichFactor)为注释到该Pathway的差异蛋白数目除以注释到该Pathway的所有鉴定到蛋白,该值越大,说明注释到该Pathway差异蛋白比例越大。图中圆点大小代表注释到该Pathway的差异蛋白的数目。

图3

图3 显著差异的pathway统计图

1.4 重复性分析

该项目利用 CV 值来评估定量的重复性。 CV=标准差SD/平均meanCV 值越低,重复性越好。下图展示重复实验的CV分布,X轴为CV分布范围,10%0~10%范围,20%10%~20%范围。Y轴为相应CV范围的蛋白数目。图右侧为各CV范围蛋白的累计比例。

图4

图4 重复实验的CV分布图

1.5 多样本间表达模式聚类

聚类分析(Cluster analysis)作为一种有效的数据分析工具,已广泛地应用于图像处理、信息检索、数据挖掘等领域。聚类分析在基因或蛋白表达数据的分析中同样有广泛的应用,主要包括:通过对基因或蛋白聚类发现未知基因或蛋白的功能:对样本聚类自动地对病理特征或实验条件进行分类,通过两路聚类找出在某些条件下参与调控的基因或蛋白簇等。

这里我们用Euclidean距离和系统聚类方法(Hierarchical Cluster)来对差异蛋白聚类。

../Documents/2018Q1工作/蛋白定量新升级/iTRAQ/Submit/BGI_result/Cluster/cluster2/pheatmap/pre-S-VS-pre-C-pre-R-VS-pre-C.inter.png

 图5

 

 

图5 差异蛋白的表达聚类图

1.6  差异表达蛋白互作分析

蛋白之间通常通过相互作用结合成复合物之后行使相应的功能。通过与STRING蛋白互作数据库比对,对差异表达蛋白进行互作分析,并且取可信度前100的互作关系绘制了网络互作图。

图6

图6 差异蛋白互作关系网络

1.7 差异表达蛋白亚细胞定位

蛋白质在核糖体中合成后经蛋白质分选信号引导后被转运到特定的细胞器中,部分蛋白质则被分泌到细胞外或留在细胞质中,只有转运到正确的部位才能参与细胞的各种生命活动。蛋白质的亚细胞定位是蛋白功能注释的重要部分。

图7

图7 差异蛋白亚细胞定位

 

2、  蛋白质组与转录组/RNA-seq表达量关联分析

对转录组与蛋白组中每个比对组所有关联上的mRNA和蛋白质的表达量相关性进行分析,如下图,展示了差异显著的mRNA和蛋白表达量一致的基因:

图8

图8 横坐标为蛋白质的表达量,纵坐标为基因的表达量

表达量关联分析的关键在于分析基因表达产物上下游的调控关系,通过整合转录组与蛋白组在同一条代谢通路上的表达量情况,可以很直观地展示基因的调控作用。

 图9

图9 网页版的形式展示,可用鼠标点击Pathway图中的各个基因,相应的蛋白和mRNA的表达量信息会出现在左上角

3、  变异与新转录本检测(需要转录组重测序/外显子/重测序数据(三选一))

转录组/外显子/重测序的数据能够提供样本中变异和新转录本的信息,通过对蛋白质组的研究,可以进一步确认在基因组、转录组水平上发生的突变和新转录本,是否在蛋白质组水平有表达,如下图:

图10

图10 三种变异类型和新转录本鉴定到的肽段数目


1、组织类样品送样要求

表1 组织类样品送样要求

样品类型

送样量

备注

新鲜动物组织干重

≥200mg

富含杂质或蛋白质含量低的样品量干重≥5g,如植物的根、木质部、韧皮部组织等

植物和蕈类真菌(如蘑菇、木耳)类

样品量湿重

≥1g

酵母、霉菌类真菌和细菌、噬菌体等微生物

200mg

新鲜培养细胞数(个)

≥3~5×106(细胞沉淀体积

约30ul~50µl左右)

血液类

血清、血浆≥500µl;全血 ≥5ml

解冻后血细胞会破裂,蛋白溶出来会影响分析,因此一般不建议送全血

2、蛋白类样品送样要求

表2 蛋白类样品送样要求

样本类型

送样量

蛋白液

≥200μg浓度≥1µg/µl


Q1:怎样选择标记定量或非标记定量?

A1:标记定量一般用于比较背景相似的样本间的蛋白组差异,若同组比较的样本数≤8,推荐选择iTRAQ标记技术;若同组比较的样本数>8且≤10,推荐选择IBT标记技术。非标记定量技术的限制情况相对较少,无论样本间背景是否相似,若同组比较样本数>10,都可推荐选择非标记蛋白定量DIA;若希望蛋白鉴定数越多越好,或需要鉴定单个样本中的特有蛋白,样本数<10,也可推荐使用DIA。

 

Q2: iTRAQ怎样设置重复?

A2:推荐至少进行2次及以上生物学重复,否则iTARQ实验结果一般不能被杂志接收。

 

Q3:不同试验的样本做iTRAQ定量可否放在一组上机?

A3:不能。因为不同试验的研究对象一般有差异,即便是同样的物种,处理方式也会有不同,这种情况下,不同来源的样本混在一起上机,会大大提高样本中蛋白种类的复杂程度,影响质谱的分辨能力,降低蛋白鉴定数目和定量效果。所以不同来源的样本,蛋白表达差异过大者,必须分别上机进行检测。

 

Q4:为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白?

A4:从生物学角度看,由于RNA调控、蛋白降解、蛋白分泌、转录和翻译效率不一致等原因,导致蛋白水平和转录水平未必呈现一样的趋势,这是正常现象。

 

Q5:只通过蛋白定量iTRAQ技术找到的差异蛋白,可否直接认定为biomarkers?

A5:从生物实验的角度来讲,通过一种实验得到的结果是需要再进行验证的。在发现阶段,用蛋白定量iTRAQ技术找到的差异蛋白,一般还需要通过其他技术进行验证后,再得出最终的结论,推荐采用目标蛋白定量MRM技术,或者传统的western blotting(Western Blot)技术进行验证。


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