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N-连接完整糖肽蛋白质组
糖基化作为一种重要的翻译后修饰，广泛存在于细胞膜表面与体液中，哺乳动物体内约50%的蛋白都被糖基化修饰。N糖基化被认为参与到细胞间信号识别、转导、调控、蛋白质折叠、定位、空间构象稳定以及免疫调控等生物学功能中，并参与到肿瘤等疾病的发生与发展。近年来，越来越多的研究表明基于位点特异性水平的蛋白质N-连接糖基化的精确表征对于许多疾病的新诊断标志物和潜在治疗靶点的发现，以及针对各种病毒的有效疫苗的开发都具有很大价值。
N糖基化修饰主要发生于 N-X-S/T（天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸，XX可以是除脯氨酸以外的任意氨基酸）的特定氨基酸基序上，N糖链主要由与天冬酰胺上相连的五糖核心和还原末端的分支天线组成，五糖核心是由两个N-乙酰葡糖胺与三个甘露糖组成的N糖链共有结构，五糖核心也会进一步被一些单糖修饰：被核心岩藻糖修饰的五糖核心，平分型五糖核心，被核心岩藻糖修饰的平分型五糖核心。根据五糖核心外围生长的天线类型，糖链又可被分为三种糖型，高甘露糖型——糖链两侧的分支仅由甘露糖组成，复杂型——糖链两侧的分支由N-乙酰葡糖胺、半乳糖、唾液酸与岩藻糖等组成，混合型——糖链两侧的分支一侧为高甘露糖分支一侧为复杂分支。
传统的N-连接糖蛋白质组定量分析去除了糖链，只对去糖基化多肽进行分析，缺失了复杂的糖链中蕴藏的遗传信息。基于完整糖肽的方法对N-连接糖蛋白质进行研究，可以同时获得糖链结构、糖基化修饰肽段及糖链和糖基化位点的对应关系等信息，为蛋白糖基化研究提供更全面的解决方案。通过标记定量技术可以在一次实验中对多达18个糖蛋白样品进行定量比较，该定量方法几乎可以对任何蛋白样品进行定量分析，具有高定量精度的特点，目前已经越来越广泛地应用于定量蛋白质组学领域。
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产品名称 |
产品优势 |
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N-连接完整糖肽鉴定 |
真结构：StrucGP软件实现真正意义上的糖链结构解析。 超全面：同时获得糖链结构、糖肽及糖链和糖基化位点的对应关系。 高深度：常规全谱鉴定5,000+，超深度检测可达14,000+；定量鉴定糖肽2,700+。 高通量：TMT/IBT标记定量可同时对多至18个样本进行检测。 |
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N-连接完整糖肽IBT/TMT定量 |
（1）N-连接完整糖肽鉴定
N-连接完整糖肽鉴定分析从蛋白质的提取开始，经过酶解、混合阴离子交换固相萃取柱（Max柱）富集，之后经过高效液相分离，在质谱上机分析时采用HCD 20.00-33.00的阶梯能量碎裂模式。StrucGP首先在包含氧鎓离子的高能量谱图中对N-连接完整糖肽中的多肽链序列进行鉴定，随后在低能量谱图中通过模块化鉴定策略对N-连接完整糖肽的核心结构、糖型与分支结构进行解析，进而完成对N-连接完整糖肽的鉴定。
图1 N-连接完整糖肽鉴定技术流程
（2）N-连接完整糖肽IBT/TMT定量
IBT或TMT定量方法可以在一次串联质谱实验中同时比较多至16/18个样品中的蛋白的相对含量，分别为蛋白提取、酶解、标记、混合糖肽富集、高效液相分离和液相串联质谱分析。在一级质谱时，平衡基团可以确保无论用哪种报告离子标记肽段，都显示为相同的质荷比值。在二级质谱时，平衡基团发生中性丢失，报告离子的强度可以反映肽段的相对丰度值，其余峰为肽段碎裂后的子离子峰，用于后续鉴定。
图2 N-连接完整糖肽定量技术流程
信息分析内容：
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信息分析条款 |
信息分析内容 |
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标准信息分析 |
1 N-连接完整糖肽鉴定结果 1.1鉴定结果统计 1.2 糖结构与位点热图 1.3 糖基化位点数量分布图 1.4 Motif图 1.5 特殊单糖分布图 1.6 糖型、糖核心和分支的拆解 1.7 Top 10糖链分布图 1.8 高分布糖链谱图标注 2 N-连接完整糖肽定量结果 2.1 差异表达糖蛋白火山图 2.2 聚类热图 3 糖蛋白功能分析 3.1 GO注释 3.2 KEGG注释 3.3 蛋白互作分析 3.4 亚细胞定位 |
1、新型冠状病毒刺突蛋白的结构和位点特异性N-糖基化修饰研究
Structural-and Site-Specific N-Glycosylation Characterization of COVID-19 Virus Spike with StrucGP. Anal Chem.2022
实验背景：
刺突蛋白（S）在新型冠状病毒（SARS-CoV-2）进入宿主细胞以及免疫逃避过程中起着关键作用，本研究利用结构和位点特异性N-连接糖蛋白组学测序算法StrucGP，在位点特异性水平上提供了S蛋白的N-糖基化修饰结构。
实验设计：
利用N-连接完整糖肽解析软件StrucGP对SARS-CoV-2病毒S蛋白每个糖基化位点上修饰的糖链结构进行解析。
主要结果：
1）提供了包含糖链结构信息的新冠S蛋白糖基化修饰图谱。特殊/不常见的糖链结构以及糖链结构异构体在20个糖基化位点上被精确解析；
2）S蛋白的位点特异性糖链结构信息可为进一步的糖基化功能研究提供坚实的基础。
图1 COVID-19病毒刺突蛋白三聚体的整体糖基化特征
2、糖蛋白组学分析显示核心岩藻糖促进上皮-间充质转化（EMT）
Site-specific glycoproteomic analysis revealing increased core-fucosylation on FOLR1 enhances folate uptake capacity of HCC cells to promote EMT. Theranostics. 2021
实验背景：
上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)被认为是包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）在内的许多癌症向高侵袭转移的重要一步，但EMT促进机制尚不清楚。
实验设计：
完整糖蛋白组学方法系统研究了HGF/TGF-β1诱导肝癌细胞EMT过程中位点特异性糖基化的动态变化，再利用各种分子生物学方法进一步证实了EMT相关糖蛋白和位点特异性聚糖的可能作用。
主要结果：
利用质谱分析的方法，SMMC-7721和HepG2细胞系共鉴定了2306个完整糖肽，通过StrucGP分析软件发现核心岩藻糖在复杂N-聚糖中所占比例最大。通过对完整糖肽的定量分析发现大部分来自叶酸受体α (FOLR1)的核心岩藻糖型完整糖肽在三个HGF处理的细胞系中上调。同样，在TGF-β1处理的SMMC-7721和Hep3B细胞中，FOLR1的核心岩藻糖水平上调。利用分子生物学方法，进一步证明FUT8是HGF/TGF-β1诱导的EMT的驱动因子。FUT8的沉默降低了核心岩藻糖水平，部分阻断了HGF诱导的EMT的进展。最后，本研究证实了FOLR1，特别是糖苷Asn-201位点的核心岩藻糖水平正调控叶酸的细胞摄取能力，而叶酸的增强摄取可以促进HCC细胞的EMT。
图2 EMT过程中肝癌细胞系的动态定点糖基化和蛋白质组分析的工作流程图
1、质控分析
PCA图
2、N-连接完整糖肽鉴定结果
3、N-连接完整糖肽定量及功能分析结果
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样品类型 |
送样建议量 |
最低送样量 |
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动物组织类 |
常规动物组织（脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤等） |
100mg |
50mg |
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动物坚韧组织-软骨
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100mg |
50mg |
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动物坚韧组织-毛发
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100mg |
50mg |
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细胞样本 |
悬浮/贴壁培养细胞
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1*108 |
5*107 |
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液体类 |
血清、血浆 |
500μL |
300μL |
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体液 |
2mL |
1mL |
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蛋白液 |
总蛋白 |
5mg |
3mg |
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单个蛋白（IP、CO-IP等纯化获得的蛋白液） |
20ug |
20ug |
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Q1：为何使用strucGP软件进行完整糖肽的鉴定？
A1：strucGP发表于Nature Methods期刊上（IF=47.990），是目前完整糖肽鉴定软件中影响因子最高的软件。strucGP可以对糖链的结构进行解析，精确的糖链结构信息可以指导后续验证实验中敲低或过表达的糖基转移酶与糖苷酶的选择，提高验证实验成功的概率，并为生物学事件中深度的机理与机制挖掘提供全新的分析维度。
Q2：能够进行样品内不同蛋白丰度比较吗？
A2：不可以，目前标记定量技术适合比较同一个蛋白在不同样品的相对量比较。
Q3:糖基化IBT/TMT中差异蛋白可以给出差异糖基化蛋白的上下调信息吗？
A3：糖基化标记定量是对肽段进行定量的。因为同一个糖基化蛋白的不同修饰位点的表达情况可能是不一致的，无法对糖基化蛋白进行定量，只能确认是否是差异糖基化蛋白。无法确认该蛋白具体是上调还是下调。
