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单细胞全基因组甲基化测序
单细胞全基因组甲基化研究概述
DNA的甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成 5-胞嘧啶的过程，刚被发现时被定义为第5种碱基，实际上它是一种非常关键的表观遗传学标签，对于调控和维持不同细胞类型的转录程序起到极其重要的作用。
同一个生物个体内几乎所有不同类型的细胞都拥有几乎完全相同序列的基因组DNA，相同序列的 DNA 分子可以有大量不同的甲基化修饰状态，正是这些甲基化修饰状态的不同，使得每种类型的细胞，甚至是每个细胞都有自己特定的基因表达特点。这些不同的修饰以及修饰的组合，使得不同种类的细胞，或者同种细胞类型不同细胞间产生异质性。这种单细胞水平的细胞类型特异的基因组甲基化修饰状态，是表观遗传学领域的重要研究方向。
研究流程
技术优势
- 首先对细胞进行BS处理，再加接头扩增，尽可能减少单细胞内DNA甲基化修饰的损失。
- 在随机引物扩增过程加接头，减少操作步骤、降低DNA损耗。
信息分析内容
1. 去接头污染、低质量的reads，并统计数据产出量及测序质量；
2. 将Clean Data中的reads比对到ref基因组，并统计比对率、duplication rate、Insert Size分布及平均测序深度；
3. 全基因组C位点的甲基化信息计算，并统计BS转化率及C位点的深度-覆盖度；
4. CGI、promoter区域的C位点覆盖度；
5. 甲基化水平的分布：
a) 多样本时，各样本全基因组上的整体平均甲基化率的分布；
b) 全基因组（n kb窗口）的甲基化水平的分布及图形展示；
c) 各样本中，几类gene区域中，甲基化状态分布的趋势；
6. 甲基化/非甲基化 位点个数的统计，及它们在各gene元件上的个数分布；
7. 甲基化/非甲基化 区域的计算；
8. CGI的甲基化状态的展示：
a) 甲基化的、非甲基化的、中间甲基化状态的CGI的个数分布；
b) CGI平均甲基化率的分布；
9. 多样本时，样品聚类；
10. 多样本时，同质性/异质性的分析；
a) CpG位点甲基化状态的一致性计算；
b) CGI区域甲基化状态的一致性计算；
c) 样本间n kb窗口的甲基化水平的相关性；
11. Group间DMR区域的计算及注释。
单细胞全基因组甲基化测序揭示鼠肝甲基化组的强烈异质性
Single-cell genome-wide bisulfite sequencing uncovers extensive heterogeneity in the mouse liver methylome
研究概述：
通过对21个肝脏细胞和5个胚胎成纤维细胞进行全基因组甲基化测序，分析其全基因组5mC甲基化图谱，结果发现鼠肝脏细胞甲基化可变性非常高，并具有高度的异质性；其中包含H3K4mel的区域可变性非常高，promoters和CpG islands非常稳定。同时，文章发现不同基因组特点的5mC甲基化异质性也有所差异；其中非功能位点，如重复序列、内含子区域很不稳定；潜在的功能区位点，如：promoters区域较为稳定。
结果展示：
1. 单细胞全基因组甲基化的genome-wide 5mC分析结果展示：
2. 5mC 异质性分析结果展示：
图1 500bp窗口下的CpGs水平分析
图2 所有样本甲基化水平相关性分析
图3 样本聚类分析
图4 甲基化CGIs重复性分析
图5 gDMR组间甲基化差异程度分布
图6 DMR相关基因的GO聚类分析
样品要求：
- 裂解好的单细胞：细胞数目为实际数目的两倍（如客户计划做5个细胞，应该至少送10个细胞）；
- 细胞培养物（细胞系、原代培养细胞等）：完整且有活性的细胞数量不少2x105
个；
- 新鲜组织：组织尺寸不小于1cm3 或者消化后细胞数目不少于1x107 个（BGI
仅提供通用组织消化方法，不同组织消化条件略有不同，需要自行测试）。
- 血液：不少于5ml EDTA 抗凝血。
Q1：单细胞全基因组甲基化测序大致流程如何？
单细胞分离（口吸管法）→单细胞裂解→Bisulfite转化→Index建库&PCR→文库质检→上机测序→信息分析→结果交付。
Q2：单细胞全基因组甲基化测序建议测多深的覆盖度？
对单细胞样品来说，建议测序深度4X-5X即可。实验数据表明，单个细胞在clean data为3X数据量的情况下，其CpGs的覆盖度为20%，并趋于饱和态。
Q3：单细胞全基因组甲基化的技术稳定性及重复性如何？
测评数据表明，使用单细胞全基因组甲基化建库方法进行建库测序的多细胞（Bulk）样品CpG位点一致性可达79.52%，说明该方法的稳定性及重复性较好。
图1 500bp窗口下的CpGs水平分析
Bulk为多细胞样本，CpG位点的一致性为：79.52%。其中包含了4个样本：Bulk1(5ug)，Bulk2(50ng)，Bulk3(50pg)，Bulk4(15pg)。
YHsc为单细胞样本，单细胞文库间的相关性较多细胞（Bulk）样本差，分别为62.34%，说明单细胞间的异质性是比较明显的。
