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产品服务

Sequencing services

空间转录组

       空间转录组技术2020年被nature method评为年度技术,基于单细胞组学在近三年发展起来的新兴领域,可以解析时间和空间维度上单个细胞的基因表达模式,以及细胞类群的空间位置关系及生物学特征。对于理解细胞生物学,发育生物学,神经生物学,肿瘤生物学等的关键信息至关重要,因特定的细胞类型及其特定组织与生物学活性至关重要,可以填补组织和器官水平上位置与功能关系研究的空白。


应用领域

  • 发育调控:

胚胎发育/细胞分化-调控图谱绘制/细胞发育路线拟合等

  • 肿瘤/疾病:

致病机理/调控网络/转录因子研究中细胞位置与功能关系研究等


产品优势

  • 前沿热点信息分析:紧跟热点分析方法趋势,可实现高通量单细胞RNA-Seq与空间转录组联合注释分析;
  • 采用最新研究工具:采用Seruat V4.0,优先发文,快人一步;
  • “0”单细胞数据拆分错误#:搭载DNBSEQTM测序系统,不惧样本间单个细胞数据弄混;
  • 丰富的项目经验:华大基因成立至今,单细胞服务业务国内首家,合作伙伴遍布全球,多项科研成果在顶尖杂志上发表。


研究流程

  • 实验流程,主要分为两大步骤:

1)预实验阶段:

a. 将样本进行冷冻后,使用Optimal Cutting Temperature (OCT)化合物进行组织包埋,且需要进行位置信息标记;

b. 其次根据研究目的,进行冷冻切片制备后,选取部分切片进行RNA质检;

c. 如RNA质检合格后,将进行透化实验- 透化时间的摸索,根据RNA释放的质量和完整性情况,决定后续正式实验中透化的实验条件。

2)正式实验:

a. 将继续完成正式冷冻切片制备,进行甲醛固定,组织透化,HE染色,显微镜拍照成像;

b. 再将组织切片贴合在含有与RNA结合捕获探针的载玻片上捕获区域,并进行固定和透化,使细胞中的mRNA得到释放,结合到相应的捕获探针上;

c. 将捕获的RNA为模板,进行cDNA合成和文库构建;

d. 对制备好的文库进行DNBSEQ平台测序。


图1  基于10x Visium空间转录组工作流程图

  • 测序策略

测序平台:DNBSEQ平台

测序读长:PE100

数据量推荐:最多测定芯片上5000spot点,测序1lane-约300Mreads(数据上下浮动20%)


  • 信息分析阶段

信息分析条款

信息分析内容

标准信息分析

(需要基于良好的参考序列, 且每个样本拆分出的细胞数目上下浮动在20%或以内的误差皆属于正常范围

基本分析

1.测序结果统计;

2.比对结果统计;

3.定量分析 ;

 

标准分析

4. 质控(细胞周期因素去除,双胞去除等);                    

5. spot聚类分析;

6. 样本间差异基因鉴定;

7. spot类别鉴定;

8. sopt点位置信息分析

9. 差异表达基因GO功能分析;

10.差异表达基因Pathway功能分析;

11.差异表达基因TF编码能力预测;

12.差异表达基因蛋白互作分析;

13.基因相关性网络分析;

14.Reactome富集;

15.GSEA 富集(选做,需2个样本以上);

16.GSVA 富集;

 

个性化分析

17.RNA速率;

18.细胞通讯iTALK;(需要确定终版细胞类群);

19.细胞通讯cellphoneDB;(需要确定终版细胞类群);      

20.细胞轨迹分析;(需要指定细胞类群);

21.CNV分析(选做,肿瘤和对照-2个样本以上);                                                                                                                                                                       

定制化信息分析

可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析内容



空间转录组应用- 肿瘤研究方向(多组学联合分析)

Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma

发表杂志: Cell

发表时间: 23 July 2020

肿瘤类型:人皮肤鳞状细胞癌

研究内容:

       为了定义皮肤鳞状细胞癌(cSCC)的细胞组成和结构,本文结合空间转录组学和一系列离子束成像的单细胞RNA测序等技术, 研究皮肤鳞状细胞癌和正常皮肤的差异, cSCC表现出四个肿瘤亚群,三个概括正常的表皮状态,以及癌症特有的肿瘤特异性角质形成细胞(TSK)群体,单细胞和空间数据映射的配体-受体网络的整合针对特定的细胞类型,揭示了TSK细胞是细胞间通讯的枢纽。这些数据定义了cSCC肿瘤和基质细胞亚群,通过空间转录组研究,进一步研究目的细胞群互做关系,以及他们参与癌症的交流基因网络。

方案设计:


图 1  实验方案设计整体流程图


主要研究结果展示:

1.    通过scRNA-Seq发现特异性的细胞亚群—— 癌症所特有的肿瘤特异性角化细胞(TSK)


图2  细胞类群对比结果图


2.    将scRNA-Seq目的研究细胞群-肿瘤角质细胞(TSK)与肿瘤空间结果进行联合分析,展现TSK细胞在空间位置上基因表达情况,以及TSK标记marker基因MMP10


图3  联合注释分析及TSK细胞空间定位与marker基因鉴定



参考文献:

[1] Ji A L, Rubin A J, Thrane K, et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma[J]. Cell, 2020, 182(2): 497-514. e22


结果展示


                      图1 单细胞类群二维聚类图                                 图2 单细胞类群在映射到样品原空间位置


图3 单细胞类群在空间位置上注释信息



图4  联合scRNA-Seq数据进行联合注释


1.    OCT冷冻包埋送样;

2.    组织切块大小建议0.65mm^3。

* 详细方法请见送样建议以及OCT包埋方法


Q1. 可以邮寄速冻组织吗?

答: 不可以,建议新鲜样本使用OCT包埋好,进行邮寄;如有切片设备,可以切到目的区域后,再进行邮寄。


Q2. 实验方案设计中一般需要切片多少片?

答:建议根据实验目的和研究方向进行考虑,根据目前现有发表文献进行总结和建议如下,供参考:



Q3. 信息分析可以关联高通量单细胞RNA-Seq测序吗?

答: 可以,通过两种组学各细胞基因表达量等相关数据,利用seruat软件进行关联分析,实现高通量单细胞数据补充注释空间转录组结果。


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