本期科技君强推的BGISEQ平台PCR-free重测序，不仅建库流程无PCR，测序流程也无PCR，最大程度避免了PCR引入的错误和偏向性，让测序得到的是真实的序列信息，更有利于检测真InDel。

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BGISEQ平台PCR-free重测序实现了建库和测序过程的真PCR-free。如图1所示，对于I平台，测序过程必须通过桥式PCR扩增获得分子簇（cluster），才能达到放大检测信号的目的，即使是PCR-free建库（图2），在建库测序过程中最少也要有一步PCR。

而基于DNBSEQTM技术的BGISEQ测序平台，如果采用PCR-free建库（图3），那么可以保证建库过程中样本制备不会引入扩增错误和扩增偏向性；测序过程中采用滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA），只以最初的单链环状文库为模板进行线性扩增，不会有PCR过程中错误的累积，真正实现了从建库到测序的“0”PCR。所以BGISEQ平台PCR-free重测序将无扩增错误的PCR-free文库建库方法与无拷贝错误累积的DNBSEQTM技术结合起来，实现真正的全基因组PCR-free测序，还原基因组真相。

图1  I平台两步PCR测序

图2  BGISEQ平台和I平台一步PCR测序

图3 BGISEQ平台“0”PCR测序

与I平台的PCR建库测序相比，BGISEQ平台PCR-free重测序检测InDel精准度和敏感度高出近8个百分点，基因组高置信区多检测真InDel达37000多个。

与I平台的PCR-free重测序相比，BGISEQ平台PCR-free重测序在基因组高置信区多检测真InDel也近18000个。所以BGISEQ平台PCR-free重测序相比其他平台和PCR建库，能检测到更多真实InDel！

图4 各平台PCR-free和PCR建库测序变异精准度和敏感度比较

注：数据来源于NA12878标准品30X重测序数据（更多信息详见>>）。

建库测序过程中，如果有PCR扩增过程对基因组覆盖度均一性有较大影响。对于DNA模板而言，有的二级结构复杂，有的热稳定性差异大，这些因素都会影响PCR扩增效率。所以，在PCR扩增过程中无法保证所有基因组片段都能获得相同的扩增效率，而是存在明显的扩增偏向性，譬如在基因组高GC或低GC区域覆盖度低。但是BGISEQ平台PCR-free重测序全程无PCR，与PCR建库测序相比，在基因组高GC区、AT/TA重复区域覆盖度有大幅提高。

图5 PCR-free建库相比于PCR建库在基因组不同特征区域覆盖度的提升

注：Huge GC（gc>80%）-GC 含量高于80%，长度大于100bp区域；AT Dinucleotides -AT或TA串联重复序列，长度大于30bp；数据来源于小鼠24X重测序数据。

如图6所示，BGISEQ平台 PCR-Free的重测序深度频率分布（图6-左图，红色柱状图）非常接近于泊松分布的理想的测序深度频率（图6-左图，蓝色线状图），说明测序数据具有很好的基因组覆盖均一性。

值得注意的是，虽然BGISEQ平台PCR-free建库测序结果比PCR建库好，但是后者测序结果与理想情况相差也不大。而I平台的PCR-free建库结果比较符合理想情况，但PCR建库结果与理想情况差距较大（图7）。对于重测序检测变异而言，为了保证检测结果的准确性，需要有多条测序reads支持，如果某个区域覆盖度低，会导致在这些区域检测的变异准确度无法保证可能被过滤掉，如果为了保证这些区域的覆盖深度达到检测要求，那么测序数据量要大幅提高，带来测序成本的增加。

图6 BGISEQ平台PCR-free建库（左）和PCR建库（右）重测序深度频率分布

注：数据来源于NA12878标准品30X重测序数据，红色柱状图为测序深度频率统计结果，蓝色线图为符合泊松分布的理想测序深度频率。

图7 I平台PCR-free和PCR建库测序深度频率分布^[4]

注：图片来源于官方渠道。

所以BGISEQ平台PCR-free重测序没有PCR扩增步骤，可以避免扩增引入的偏向性，具有更好的基因组覆盖均一性，更适合GC含量异常物种的重测序。统计不同GC含量的细菌测序结果GC偏向性，如图8-10所示：以100个碱基的大小为窗口，绘制GC含量分布图。灰色水平线表示理想的归一化覆盖度，表示为1.0， 蓝色点线表示样本的实际归一化的覆盖度。蓝色点线越接近1.0， 说明样本的基因组覆盖均一性越好。测序结果表明，BGISEQ平台PCR-free文库测序对于高GC、低GC物种基因组覆盖均一性与GC正常物种表现非常接近。

图8 GC含量62%的细菌（Olsenella Profusa）测序结果GC偏向性统计结果

图9 GC含量50%的细菌（E.coli）测序结果GC偏向性统计结果

图10 GC含量38%的细菌（Bacillus megaterium）测序结果GC偏向性统计结果

注：数据来源于3种不同GC含量的细菌30X测序

BGISEQ平台PCR-free重测序不仅测试结果表现优异，在商业项目中，表现也很稳定。统计5492个文库动植物BGISEQ平台PCR-free重测序数据，下机数据Raw data %20平均为96.95，%30平均为89.14。

图11 动植物BGISEQ PCR-free重测序下机数据质量

统计250个 BGISEQ PCR-free 人重文库测序结果，数据表现同样优秀。

①下机数据Raw data %Q20平均为97.36，%Q30平均为90.01。

图12 人重BGISEQ PCR-free测序质量

② %GC含量平均值41.62%，符合人基因组序列特征。

图13 人重BGISEQ PCR-free 测序GC含量

③比对率平均值达到99.78%。

图14 人重BGISEQ PCR-free 测序比对率

④平均Duplicates比率2.36%，意味着用更少的Raw Data可以获得更高的有效深度和基因组覆盖度。

图15 人重BGISEQ PCR-free 测序Duplicates_Rate

参考文献

[1] Mcinerney P, Adams P, Hadi M Z. Error Rate Comparison during Polymerase Chain Reaction by DNA Polymerase.[J]. Molecular Biology International, 2014, 2014:287430.

[2] Aird D, Ross M G, Chen W S, et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries[J]. Genome Biology, 2011, 12(2):R18.

[3] Han F, Wu Y, Narzisi G, et al. Reducing INDEL calling errors in whole genome and exome sequencing data[J]. Genome Medicine,6,10(2014-10-28), 2014, 6(10):89.

[4]https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/datasheets/datasheet_truseq_dna_pcr_free_sample_prep.pdf