logo

logo

市场活动

Market activity

产品促销

Product promotion

单细胞测序前的3大关键问题,您都处理对了吗?

在无数实战经验中,制备高质量的单细胞悬液被公认为重中之重。实验过程中,如单细胞活性不高,细胞数过低,以及污染和杂质等问题,都会影响到有效单细胞数的产出、单细胞核酸的质量等,最终得到的单细胞数据分析及统计结果不可信。

那么,组织如何解离?需要选什么酶?还需要注意什么?科技君根据相关权威文献整理了单细胞悬液制备的方法和小贴士,让我们一起来解决单细胞研究方案中的拦路虎。


一、实体组织解离关键——酶的合理选择

实体组织解离两大步骤,包含机械分离和酶消化处理。


首先,组织需要通过物理切割或刀片切碎,然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间不同,相关建议可参考如下表格:人和小鼠的部分组织类型——肝脏、肺、皮肤、脾脏、消化道、胰腺、肾脏、视网膜等[1]


表1 人鼠各类型组织酶解单细胞悬液方法总结[1]

1

除此之外,常用酶的类型还包括:AccutaseTM、弹性蛋白酶和胶原酶,以及商业酶混合物,如 TrypLE Express 和 Liberase Blendzyme 等[1],当然也可以选择美天旎品牌的各类组织解离试剂盒。


另外,科技君也总结已发表文献中常见实体组织解离所采用的酶,供大家参考,步骤详见参考文献:


  • 小鼠心脏肌肉组织:Collagenase IV and Dispase II[2] 

  • 上皮组织:dispase(Corning) -商业化试剂[3]

  • 小鼠胚胎组织:TrypLE Express[4] 

  • 乳腺癌及其癌旁组织:  Liberase TL (Sigma) -商业化试剂[5]

  • 小鼠主动脉血管:Collagenase type II (C6885, Sigma Aldrich) 和 Elastase (LS002292, Worthington Biochemistry)[6]

  • 小鼠脑垂体:Collagenase type II, trypsin, DNase I,amphotericin B 混合[7]




二、血液处理成关键——离心稳定操作[1]

样品经过密度离心(例如使用Ficoll-Paque或Histopaque-1077技术),可以直接用于外周血单核细胞(PBMC)捕获[1]


建议不少于5mL EDTA 抗凝血,且不要使用肝素抗凝管收集血液;同时注意在合适转数离心操作后,管中内容物分为三层,上层为血浆(内含细胞碎片),中间层为分层液,底层为红细胞,在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单核细胞层( 白膜层,薄)。此时,需使用无菌吸管小心沿离心管壁周缘吸取界面层单核细胞后,再加入HBSS /PBS重悬。更多注意事项请参见华大科技单细胞送样建议。


三、单细胞悬液制备的8条建议[1]

1. 建议采用无菌样品处理方式,包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。


2. 为降低对细胞的损伤,移液和离心应保持在最低程度。在一定的离心速度、时间和温度下,细胞浓度和大小直接影响制备的效率。


3. 在进行细胞清洗和重悬过程中,使用具有合适大小的器皿,避免高浓度导致细胞集聚和结块,请注意选择。


4. 应使用适当大小的细胞过滤器过滤悬浮液,孔径大于细胞直径,以去除团块和碎片。


5. 细胞清洗和复苏,推荐使用含牛血清的磷酸盐缓冲盐水(不含钙和镁),减少细胞损失和聚集的白蛋白。


6. 细胞裂解升高可导致细胞团块形成,在细胞分离过程中,DNase I可减少细胞团块形成。


7. 细胞团块会导致自动细胞计数器低估单个细胞的有效浓度,因此制备后应尽快处理悬浮液,最好在30分钟内处理。


8. 总之,在单细胞制备中,尽可能减少细胞聚集物、死亡细胞、非细胞核酸和逆转录(RT)抑制剂是非常重要的。为了在最大限度地提高不同细胞类型的纯度和无偏回收率的同时,最小化这些污染物,可能需要应用优化,例如,调整洗涤步骤的数量、洗涤溶液的组成、离心条件和/或过滤器类型。


华大科技开启国内单细胞研究先河,10年研究服务技术沉淀,为您提供全方位的单细胞研究服务。

2

参考文献:

[1] Lafzi, Atefeh, et al. "Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies." Nature protocols (2018): 1.

[2]Skelly, Daniel A., et al. "Single-cell transcriptional profiling reveals cellular diversity and intercommunication in the mouse heart." Cell reports 22.3 (2018): 600-610.

[3]Cheng, Jeffrey B., et al. "Transcriptional programming of normal and inflamed human epidermis at single-cell resolution." Cell reports 25.4 (2018): 871-883.

[4]Pijuan-Sala, Blanca, et al. "A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis." Nature 566.7745 (2019): 490.

[5]Azizi, Elham, et al. "Single-cell map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment." Cell 174.5 (2018): 1293-1308.

[6] Hadi, Tarik, et al. "Macrophage-derived netrin-1 promotes abdominal aortic aneurysm formation by activating MMP3 in vascular smooth muscle cells." Nature communications 9.1 (2018): 5022.

[7] Cheung, Leonard YM, et al. "Single-cell RNA sequencing reveals novel markers of male pituitary stem cells and hormone-producing cell types." Endocrinology 159.12 (2018): 3910-3924.