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UMI Small RNA测序

        UMI Small RNA测序,文库构建时引入特异性分子标签(UMI),结合高通量测序,研究某物种某组织在特定时空状态下18-30 nt的small RNA片段序列信息,实现精准定量,通过与数据库比对, 可实现small RNA序列的鉴定、靶基因分析和功能分析, 以及包含miRNA、siRNA、piRNA等多种small RNA类型的分析研究需求等。主要应用在动植物生长发育调控研究、抗病抗逆调控研究、生物性状及突变调控研究等;在疾病研究方面,可研究疾病发生调控机制、寻找生物标记、靶向药物研究等。

技术优势

1.  实验方法升级,数据库更新,sRNA定量结果更可靠

建库引入UMI技术,实现无偏向的精确定量,矫正原有70%的reads定量偏差;采用权威miRBase数据库、KEGG数据库;

2.  实验技术经验丰富,低起始量成功率高,技术重复性高

已完成350多种不同物种的项目,常规样本单次建库只需100ng,血清血浆样本只需20ng;小RNA样本实现最低1 ng起始量;低起始量建库成功率达95%;建库、测序技术重复性高;

3.  多样的样品类型,满足多角度研究需求

接收除常规样品以外的血清、血浆样品、组织液样品、FFPE样品、外泌体、RIP富集RNA等多种类型;

4.  Dr.Tom系统交付,多种个性化分析任您选

采用Dr.Tom多组学数据挖掘系统,10大数据库注释,多维度结果图片展示,数据图表循环挖掘;

5.  无忧解决售后

可根据客户需求进行贴身个性化服务,为文章撰写提供技术服务。

研究内容

        利用DNBSEQ平台,对富集到的18-30nt的小RNA片段进行测序,对获得的有效数据进行序列长度分布统计,将筛选后的高质量序列分类注释,从而获得样品中包含的各组分及表达量信息,并对所有小RNA片段进行注释,对miRNA进行靶基因预测等分析。


标准信息分析

1.  数据产出统计,对原始信息采集数据去接头污染,去低质量reads

2.  small RNA 信息采集结果的长度分布

3.  small RNA在选定的参考基因组上的分布

4.  small RNA分类统计

5.  miRNA定量分析

6.  miRNA差异表达分析

7.  miRNA表达/差异表达聚类分析

8.  miRNA靶基因分析

9.  差异miRNA 靶基因GO 注释和KEGG 通路分析

高级信息分析

一)数据库注释

1. 转录因子注释(AnimalTFDB/PlantTFDB)

2. GSEA分析

3. Rfam、Pfam、Reactome、COG、EggNOG和InterPro数据库注释

二)互作网络分析

1. 靶基因分析

① miRNA-mRNA靶向关系分析

② lncRNA-mRNA靶向关系分析

2. ceRNA互作网络分析

3. 蛋白互作网络分析

4. 共表达互作网络分析

三)特色分析

1. 外部数据库关联分析(TCGA、ARCHS4)

2. 关键驱动基因网络图分析


案例一、miRNA机制研究——以 Rubicon 依赖的方式产生的外泌体 miRNA 参与调控了细胞衰老[1]

文章题目:The Rubicon-WIPI axis regulates exosome biogenesis during ageing

发表期刊:Nature Cell Biology,影响因子 17.3

发表时间:2024 年 9月

研究摘要:

       细胞通过在多囊泡体中释放外泌体与其他细胞进行通信。尽管最近的研究表明外泌体生物合成与自噬之间存在密切联系,但详细机制尚未完全阐明。本研究采用全面的 RNA 干扰筛选自噬相关因子,并发现 Rubicon 作为自噬的负向调节因子,对外泌体的释放调控至关重要。Rubicon 招募 WIPI2d 至内吞体以促进外泌体生物合成,后续对 WIPI2d 的互作分析鉴定了形成内腔小泡所需的 ESCRT 组分。研究还发现 Rubicon 对于小鼠中外泌体的释放调控与年龄增加具有强相关性。值得注意的是,血清外泌体中的小 RNA 测序揭示了 Rubicon 决定与细胞衰老和长寿途径相关的外泌体微小 RNA 的生成。综合来看,实验结果表明 Rubicon-WIPI 轴作为外泌体生物合成的关键调节器,并负责外泌体中 miRNA 数量和质量的年龄依赖性变化。

部分研究结果展示:

图2

图1  Rubicon的缺失与年龄影响外泌体miRNA profile的变化


案例二、疾病miRNA机制研究——血小板来源外泌体促进败血性休克中性粒细胞胞外陷阱的形成[2]

研究摘要

       血小板已被证明是败血症期间中性粒细胞胞外陷阱(NET)形成的有效激活剂,并且主要来源于血小板的循环血浆外泌体可能在败血症期间诱发血管凋亡和心肌功能障碍,但血小板源性外泌体在 NET 形成中的作用以及与人类血小板介导NET产生有关的介体和分子途径仍不清楚。本次研究通过构建体内体外败血症模型,探究血小板源性外泌体在败血性休克过程中 NET 形成中的作用及其潜在机制。

       结果显示,NET 成分(dsDNA 和 MPO-DNA 复合物)在败血性休克患者血液中的外泌体中显著增加,并且与疾病的严重程度和预后呈正相关。在动物体内模型中,减少血小板可降低血浆外泌体浓度,NET形成以及肺损伤。机制研究表明,外泌体高迁移率族蛋白1(HMGB1)和/或 miR-15b-5p 和 miR-378a-3p 通过 Akt / mTOR 自噬途径诱导了 NET 的形成。

研究结果


图2 NET形成的增加与败血性休克期间的死亡率和严重程度有关



图3 外泌体miR-15b-5p和miR-378a-3p通过靶向PDK1促进NET的形成


 

案例三、miRNA调控机制研究——MiR396-GRFS介导油菜素类固醇对拟南芥幼苗去黄化过程中光氧化损伤的保护作用[3]

研究摘要

       从暗到光的转化对于幼苗的存活和生长至关重要,但是其潜在的调控机制仍不完善。植物生长发育所必需的一类植物甾体激素——油菜素甾体(BRs)和植物特异性转录因子——生长调节因子(GROWTH-regulation FACTORs,GRFs),二者在植物生长发育调控中发挥重要作用。

       结果表明,油菜素甾体缺陷型det2-1突变体的黄化幼苗在光照下积累了过量的原叶绿素,导致光氧化损伤。相反,获得性功能突变体bzr1-1D抑制det2-1的原叶绿素积累,从而促进黄化幼苗的绿化。此外,研究发现BZR1和PIF4诱导生长调节因子GRF7和GRF8抑制叶绿素的生物合成,促进幼苗的绿化。过表达microRNA396a抑制GRFs功能会在黑暗中引起原叶绿素的积累,并且在曝光后会发生严重的光漂白,BZR1,PIF4和GRF7相互作用,精确调控叶绿素生物合成基因的表达。

研究结果


图4 油菜素提高了暗生苗的返青率



  图5 miR396和GRFs在黄化苗返青中起重要作用


参考文献:

[1] Yanagawa K, Kuma A, Hamasaki M, et al. The Rubicon-WIPI axis regulates exosome biogenesis during ageing[J]. Nat Cell Biol. 2024 Aug 22.

[2] Jiao Y, Li W, Wang W, et al.Platelet-derived exosomes promote neutrophil extracellular trap formation during septic shock. Crit Care. 2020 Jun 29;24(1):380. 

[3] Wang L, Tian Y, Shi W,et al. The miR396-GRFs Module Mediates the Prevention of Photo-oxidative Damage by Brassinosteroids during Seedling De-Etiolation in Arabidopsis. Plant Cell. 2020 Aug;32(8):2525-2542. 


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图1  小RNA分类注释

通过与已知的sRNA数据库比对,鉴定小RNA,各类小RNA所占比例。


图2  差异表达miRNA聚类热图   



图3  差异miRNA与差异靶基因关联聚类图



图4  差异表达miRNA与差异靶基因互作网络图


表1  Small RNA组织样品送样建议

组织类型

具体要求

新鲜培养细胞(细胞数)

≥2×105 cells

新鲜动物组织干重

≥25 mg

新鲜植物组织干重

嫩叶、嫩茎≥100 mg

根、果实、种子、花等≥200 mg

全血(哺乳动物)

≥1 mL 全血分离的白细胞或

≥1 mL PAXgene® Blood RNA Tube收集的全血

全血(非哺乳动物)

≥0.1 mL 全血分离的白细胞或≥0.2 mL 全血+6TRIzol裂解液

FFPE

≥5片,未染色,100 mm25-10 μm厚度


表2  Small RNA测序样品判定标准

官网表格1


Q1:小 RNA 测序对样品提取有什么特殊要求? 

        提取总RNA时建议不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒,也不要使用LiCl沉淀,以免丢失小片段RNA。如果直接提供small RNA样品,可以使用small RNA提取专用试剂盒来进行提取。

Q2:华大可以实现什么类型的样品建库测序?

         动植物总RNA样品、微生物总RNA样品、200nt以内的小片段RNA样品、经切胶回收的small RNA样品、组织培养与细胞系样品、血清/血浆样品、组织液样品,FFPE样品、RIP样品,外泌体样本等,只要满足华大送样要求,均可在华大用于小RNA建库测序。

Q3:为什么实验结果中会存在降解的 rRNA序列? 

        由于 total RNA 常发生轻微的降解,而生物体内也有自然的降解过程,因此数据中就会含有小部分 mRNA 降解片段。但通常这个比例很低,并且取决于样品 total RNA 的质量。

Q4:进行小 RNA 测序时,客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息? 

        需要提供相应物种的基因组和相关的 exon、intron、repeat 信息。如果没有本物种的基因组,需要提供近缘物种的相关信息。 


 


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