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真核链特异性转录组测序
转录组测序，对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序，既可以提供定量分析，检测基因表达水平差异，又可以提供结构分析，能发现稀有转录本，精确地识别可变剪切位点、基因融合等，而且不依赖于参考基因组。
技术优势
1.链特异性文库：能检测反义链表达，比对率更高，定量更准确，注释、可变剪切和基因融合等结果更可靠；
2.样品起始量低：人鼠样本起始量仅需200 ng；可微量定制化建库，低至200 pg；可单细胞定制化建库，低至单个细胞；
3.高质量的自主测序平台：DNBSEQ测序技术具有滚环复制扩增带来的错误累积低和规则阵列载片带来的信号密度高等原理性优势，大幅提高了测序的准确性；而且，基于DNBSEQ测序平台的产出数据重复序列率低(Dup率低)、有效数据利用率高、标签跳跃少（Index hopping少），能有效降低“张冠李戴”的情况。
4.Dr. Tom系统：无需生信分析基础，多数据库联合分析，多维度数据展示，循环挖掘数据，轻松自主做个性化分析。
5.提供针对微量样本以及降解样本等多类型样本的不同建库技术方案，以满足不同的科研需求。
产品应用
医学上的应用方向——
农学上的应用方向 ——
研究内容
一、无参考序列物种
标准信息分析：
1. 测序数据过滤；
2. 转录组de novo组装；
3. Unigene七大功能数据库注释；
4. Unigene的CDS预测；
5. Unigene的TF编码能力预测；
6. Unigene的SSR检测；
7. Unigene表达量计算；
8. 时间序列分析；
9. 差异表达基因检测；
10. 差异表达基因聚类分析；
11. 差异表达基因GO功能分析；
12. 差异表达基因Pathway功能分析；
13. 差异基因蛋白互作分析；
14. 植物抗病基因预测（植物样本）。
定制化信息分析：
1. 可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。
二、有参考序列物种
标准信息分析：
1. 基本数据统计① 去除接头序列、低质量序列得到reads信息，② 样品相关性，③ 表达量分布，④ RNA分类；
2. 参考基因组比对；
3. mRNA鉴定；
4. mRNA定量分析；
5. mRNA差异表达分析（样本间、组间）；
6. mRNA表达/差异基因聚类；
7. mRNA差异基因GO分类、富集；
8. mRNA差异基因KEGG分类、富集；
9. mRNA结构分析：可变剪切分析；
10. mRNA结构分析：融合基因分析。
Dr.Tom信息分析：
一）数据库注释
1. 转录因子注释（AnimalTFDB/PlantTFDB）；
2. GSEA分析；
3. Rfam、Pfam、Reactome、COG、EggNOG和InterPro数据库注释；
二）互作网络分析
1. 靶基因分析① miRNA-mRNA靶向关系分析，② lncRNA-mRNA靶向关系分析；
2. ceRNA互作网络分析；
3. 蛋白互作网络分析；
4. 共表达互作网络分析；
三）特色分析
1. 自定义标签和自有数据上传；
2. 外部数据库信息（TCGA、ARCHS4）；
3. 关键驱动基因网络图分析；
4. 时间序列分析。
（*以上分析内容为部分物种可做。）
定制化信息分析 ：
1. 可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容
案例一 RAF样蛋白激酶介导一种高度保守且快速的生长素反应
文章题目：RAF-like protein kinases mediate a deeply conserved, rapid auxin response
发表期刊：Cell
影响因子：45.5
发表时间：2024年1月
发表单位：瓦赫宁根大学、查理大学、奥地利科学技术研究所、京都大学、东京理科大学
案例描述：该研究团队鉴定了一种对生长素快速全蛋白质组磷酸化的反应。这种反应发生在5种陆地植物和藻类物种上，并集中于一组核心的共同靶点。该研究鉴定出了这种生长素触发的跨物种磷酸化的中心介质是纤维肉瘤（RAF) 样蛋白激酶，遗传分析该激酶与生长素触发的蛋白质磷酸化和快速细胞反应联系起来，从而确定了绿色谱系中生长素快速反应的古老机制。
参考文献：Kuhn A, Roosjen M, Mutte S, Dubey SM, Carrillo Carrasco VP, Boeren S, Monzer A, Koehorst J, Kohchi T, Nishihama R, Fendrych M, Sprakel J, Friml J, Weijers D. RAF-like protein kinases mediate a deeply conserved, rapid auxin response. Cell. 2024 Jan
案例二 全球最大规模结直肠癌多组学研究
文章题目：Prognostic genome and transcriptome signatures in colorectal cancers
发表期刊：Nature
影响因子：50.5
发表时间：2024年8月
发表单位：中国科学院杭州医学研究所、瑞典乌普萨拉大学（Uppsala University）、华大生命科学研究院、华大基因智惠医学研究院
文章简述：该研究实现了迄今为止最大规模的结直肠癌基因组和转录组的综合分析，并将分子层面的发现与高质量的临床数据相结合，从而识别关键预后因子，这使这项研究有别于其他绝大多数癌症基因组学的研究。
研究结果：基于华大基因DNBSEQ测序平台，对瑞典U-CAN队列（Uppsala/Umeå Comprehensive Cancer Consortium）中的1,063例结直肠癌样本进行全基因组和转录组测序分析，鉴定得到了96个显著突变基因，其中，有24个为新发现的潜在驱动基因，并发现与WNT、EGFR和TGF-β通路相关的驱动基因和结直肠癌生存显著相关。利用突变时序分析，推导出9个与癌症发生早期事件相关的驱动突变基因和更倾向于在癌症发生后期阶段出现的突变基因。
这些发现为结直肠癌的早期检测和靶向治疗提供了临床研究策略，并揭示了与肿瘤后期侵袭和转移相关的重要分子变化。整合基因组和转录组数据的分子分型能得到更精细准确的患者预后分层，这对优化临床肿瘤分型、指导结直肠癌精准治疗具有重要意义，新构建的表达谱精细分型将在未来指导结直肠癌个体化诊疗中发挥重要作用。
参考文献：Nunes, L., Li, F., Wu, M. et al. Prognostic genome and transcriptome signatures in colorectal cancers. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07769-3
部分内容展示：
图1 差异聚类热图
图2 功能富集或分类图
图3 蛋白互作网络
表1 真核转录组测序核酸样品判定标准
真核转录组（默认链特异性，非链特异和链特异性送样建议相同） | |||||||
样本类型 | 总量 | 浓度 | 完整性 | 28S/18S | 基线和5S | 纯度 | |
分析仪 检测 | 电泳检测 | ||||||
Total RNA (真菌) | 1 μg | 20-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | RNA条带清晰无弥散或拖尾 | 28S/18S≥1.0 | 基线平整，5S峰正常 | 无 DNA， 蛋白/盐离子等污染， 样本无色透明， 不粘稠 |
Total RNA (植物) | 400 ng | 10-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (其他动物) | 400 ng | 10-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (非全血人鼠) | 200 ng | 5-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (人鼠细胞系) | 200 ng | 5-1,000 ng/μL | RIN≥7.0 | 28S/18S≥1.0 | |||
Total RNA (昆虫) | 400 ng | 10-1,000 ng/μL | RIN≥6.0 | NA | |||
表2 真核转录组测序组织样品判定标准
组织类型 | 真核转录组文库 |
新鲜培养细胞 (细胞数) | ≥2×105 cells |
新鲜动物组织干重 | ≥25 mg |
新鲜植物组织干重 | 嫩叶、嫩茎≥50mg 根、果实、种子、花等≥100mg |
菌体（细胞数或干重） | ≥5×106 cells 或 ≥20 mg |
全血-哺乳动物 | ≥1 mL 全血分离的白细胞 或≥1 mL PAXgene® Blood RNA Tube 收集的全血 或≥0.3mL 全血＋3 倍体积 TRIzol裂解液 |
全血-非哺乳动物 | ≥0.1 mL 全血分离的白细胞 或≥0.1 mL 全血＋6倍体积 TRIzol 裂解液 |
FFPE | ≥5片， 未染色， 组织面积≥100 mm2， 切片厚度5~10 μm |
1、DNBSEQ滚环扩增技术的特点是什么？
答：滚环扩增技术RCA的模板始终是同段序列，扩增错误不会累积，与PCR指数扩增相比具有保真优势。
2、DNBSEQ下机数据格式是怎么样的？
答：通用下机数据格式：（FASTQ）让数据兼容性更好。
3、DNBSEQ平台真核转录组推荐数据量？
答：推荐6Gb以上；
4、可否提供DNBSEQ转录组标准品测试数据供客户测评？
答：可以，我们1个UHRR标准品，构建了3个文库，测序数据可在EBI网站（http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB19428）下载。
5、链特异性文库与非链特异性文库建库主要区别是什么，链特异性文库的优势是什么？
答：链特异性文库的构建与非链特异性文库不同点在于：链特异性文库在cDNA二链的合成步骤，使用dUTP代替dTTP；
链特异性文库的优势是1）能检测反义链表达2）更精确地定量重叠的转录本 3）增强转录本注释的可信度4）提高比对率 5）检测可变剪切转录本、基因融合和等位基因特异性表达可信度高[3-7]。
6、链特异性文库与非链特异性文库在样品要求、推荐数据量和分析条款上有什么不同？
答：两者在这三方面是一样的。但是虽然分析条款是一样的，基因组比对和基因表达定量分析的参数上略有不同。所以在信息分析前（包括de novo和resequencing），生信人员需要根据建库方法（链特异性文库/非链特异性文库），来设置正确的分析参数；链特异文库碱基会根据样本实际ATCG含量，呈现不等分离，属于正常结果。
