产品介绍
16S rDNA是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”，其序列包含9个可变区（Variable region）和10个保守区（constant region）。可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。通过检测16S rDNA的序列变异和丰度，可以了解环境样品中群落多样性信息。基于16S rDNA的分析在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起到重要作用。
18S rDNA或ITS（Internal Transcribed Spacer）被广泛应用在真菌分类鉴定中。18S rDNA在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类；ITS属于中度保守区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。
研究内容
16S/18S/ITS扩增子测序即通过提取环境样品的DNA，选择合适的通用引物扩增16S/18S/ITS的某一或某几个区，使用Illumina测序将目的区域正反向读通，通过检测目的区域的序列变异和丰度，对环境样本物种分类及，丰度，种群结构，系统进化，群落比较等方面信息进行分析的研究方法。
产品优势
策略多样：不同来源样本采用不同提取方法和建库测序策略，满足多种环境研究需求。
平台多样：DNBSEQ/PacBio等多种平台可供选择，可满足16S/18S/ITS不同高变区域或全长测序的需求。
经验丰富：已测序样品类型涉及粪便、土壤、水体、唾液、牙菌斑、体腔、胃液、白带、空气、血液、皮屑等。
分析自动化：自动化分析平台，可多次提交不同的信息分析方案，客户可以主导信息分析过程。
售前、售后服务：提供结题报告解读视频及其他个性化售前售后服务。
样本需求量低：华大基因16S产品推荐DNA样本量50 ng以上；对于样本获取困难的样本，只要样本量高于0ng也有可能建库成功。
数据交付指标高：华大科技对16S产品承诺交付clean tags（用于后续OTU/物种分析的有效数据量），承诺100%满足合同数据量。常见的16S数据交付指标有raw reads、clean reads、raw tags，clean tags等，受数据质量和目标区域长度的影响，一般的数据利用率（clean reads/raw reads）和拼接率（clean tags/clean reads）会在50%~100%之间波动。
医学领域：人体微生物与人体健康/疾病的关系，人体微生物对疾病干预过程的影响；
动物领域：肠道、瘤胃（如产甲烷菌类群）与动物健康/营养消化研究等；
农业领域：根际微生物与植物互作、农业耕作/施肥处理与土壤微生物群落等；
环境领域：雾霾处理、污水治理、石油降解、酸性矿水处理及海洋环境等；
特殊极端环境：极端环境条件下的微生物类群研究，如冰川、火山等。
取质量合格的基因组DNA样品30 ng及对应的融合引物配置PCR反应体系，设置对应的PCR反应参数进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行纯化，完成建库。使用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库在华大自主的DNBSEQ平台上进行测序。下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。
16S/18S/ITS扩增子建库推荐融合引物建库方法，即提前合成融合了目标序列引物和上机接头、index等序列的引物，通过一步PCR扩增直接完成建库。主要步骤如下：
样品检测：使用Qubit对样品浓度进行精确定量，检测合格的样品进行文库构建。
PCR体系构建：取30 ng DNA样品及融合引物配置PCR反应体系。
PCR扩增：设置PCR反应参数进行PCR扩增。
产物纯化：使用磁珠进行纯化，文库构建完成。
文库质量检测：文库检测使用Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库的片段范围及浓度。
上机测序：文库检测合格，上机测序
| 扩增区域 | 引物名称 | 引物对 | |
| 细菌 | V4 | 515F | GTGCCAGCMGCCGCGGTAA |
| 806R | GGACTACHVGGGTWTCTAAT | ||
| V1-V3 | 8F | AGAGTTTGATYMTGGCTCAG | |
| 518R | ATTACCGCGGCTGCTGG | ||
| V3-V4 | 338F | ACTCCTACGGGAGGCAGCAG | |
| 806R | GGACTACHVGGGTWTCTAAT | ||
| V4-V5 | 515F | GTGCCAGCMGCCGCGG | |
| 909R | CCGTCAATTCMTTTRAGT | ||
| 真菌 | ITS1 | its1 | CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA |
| its2 | GCTGCGTTCTTCATCGATGC | ||
| ITS2 | its3 | GCATCGATGAAGAACGCAGC | |
| its4 | TCCTCCGCTTATTGATATGC |
*注：只有两端完全测通的Reads (Tags)才能用于进一步的分析，目前短读长测序最长测序读长为PE300，片段范围在530以上的建议选择长读长测序来做。
下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。
分析模块 | 信息分析条款 |
| 数据处理 | 数据过滤 |
| Reads拼接 | |
| OTU聚类及分析 | OTU统计 |
| OTU venn图分析 | |
| Core-Pan OTU分析 | |
| OTU PCA分析 | |
| OTU NMDS分析 | |
| 物种累计曲线分析 | |
| OTU PLS-DA分析 | |
| OTU Rank曲线 | |
| 物种分类 | 物种丰度柱状图（多方案展示） |
| 物种丰度热图（多方案） | |
| 物种系统发育进化分析 | |
| GraPhlAn物种组成图 | |
| 物种PCA分析（样本≥ 3） | |
| 菌群分型分析样本（肠道样本） | |
| 单个样品多样性分析（alpha多样性） | Alpha多样性统计表（包括observed species指数（sobs）、chao1指数、ace指数、shannon指数和simpson指数） |
| Alpha多样性稀释曲线（多方案） | |
| Alpha多样性盒形图 | |
| 样品间多样性比较分析（beta多样性） | Beta多样性热图（Bray-Curtis，weighted UniFrac，unweighted UniFrac） |
| 样品聚类树 | |
| PCoA | |
| UPGMA 聚类树与丰度组合图 | |
| Beta多样性指数组间差异分析（分组≥2，每组样本数≥3） | |
| 物种差异分析（分组≥2，每组样本数≥3） | LEfSe分析 |
| Wilcox Test | |
| Kruskal Test | |
| 相似性分析检验分析（Analysis of similarity，ANOSIM） | |
| PERMANOVA/Adonis分析（如关注物种与表型的关联需提供表型信息，否则默认分析物种与分组关联） | |
| 关键物种差异比较柱状图 | |
| 功能分析 | KEGG功能预测 |
| KEGG对应酶的编号及通路图 | |
| COG功能预测 | |
| 功能差异分析（Wilcox Test、STAMP） | |
| 关联分析与模型预测（个性化分析） | CCA/RDA分析（需提供详细的环境因子数据） |
| Spearman相关系数分析（需提供表型信息） | |
| 物种间相关系数网络图分析 | |
| 随机森林--ROC曲线（分组=2，每组样本数≥30） | |
| SourceTracker（需要提供样本来源信息） |
